Zautomatyzowany system może przyspieszyć wykrywanie ognisk zakażeń
Pathogen2Read automatyzuje przygotowanie próbek do sekwencjonowania bakterii
Inżynierowie biomedyczni z Brown University opracowali w pełni zautomatyzowany system przygotowywania próbek bakteryjnych do sekwencjonowania genomowego. Metoda Pathogen2Read może skrócić czas pracy laboratoryjnej, poprawić wykrywanie bakterii Gram-dodatnich i ułatwić mniejszym laboratoriom udział w sieciach nadzoru epidemiologicznego.
Na czym polega system Pathogen2Read
Inżynierowie biomedyczni z Brown University opracowali w pełni zautomatyzowany proces, który upraszcza i przyspiesza przygotowywanie próbek bakteryjnych do sekwencjonowania genetycznego.
Metoda, nazwana Pathogen2Read, usprawnia jeden z najważniejszych i najbardziej czasochłonnych etapów sekwencjonowania. Może umożliwić niewielkim laboratoriom, które nie dysponują rozbudowanymi systemami automatyzacji wysokoprzepustowej, skuteczniejsze uczestnictwo w sieciach monitorowania ognisk chorób prowadzonych przez U.S. Food and Drug Administration oraz Centers for Disease Control and Prevention.
W praktyce mogłoby to przyczynić się do szybszego reagowania na ogniska chorób przenoszonych przez żywność oraz inne zdarzenia epidemiczne.
Sekwencjonowanie nowej generacji stało się podstawowym narzędziem wykrywania ognisk chorób i zapobiegania im. Przygotowanie próbek nadal wymaga jednak pracochłonnych czynności manualnych i izolowania hodowli, co może opóźniać reakcję na ognisko w czasie rzeczywistym. Nasze laboratorium opracowało – zgodnie z naszą wiedzą – pierwszą w pełni zautomatyzowaną metodę naukową, która omija te ograniczenia.
Badanie opisujące metodę i wyniki jej testów przeprowadzono we współpracy z naukowcami z FDA oraz przy wsparciu finansowym firmy biotechnologicznej Revvity. Wyniki opublikowano w czasopiśmie BMC Genomics.
Znaczenie sekwencjonowania w epidemiologii
Sekwencjonowanie nowej generacji istotnie zmieniło współczesną epidemiologię. Pozwala naukowcom w ciągu kilku godzin lub dni poznać pełne sekwencje genomów mikroorganizmów podejrzewanych o wywoływanie chorób.
Dzięki temu badacze oraz specjaliści zdrowia publicznego mogą szybciej identyfikować patogeny odpowiedzialne za ogniska zachorowań, porównywać izolaty pochodzące od pacjentów, żywności lub ze środowiska oraz wykrywać nowe mutacje genetyczne. Część takich zmian może wpływać między innymi na zjadliwość mikroorganizmu, jego zdolność do transmisji lub wrażliwość na leczenie przeciwdrobnoustrojowe.
Mimo postępu w technologii sekwencjonowania przygotowanie próbek pozostaje procesem złożonym i pracochłonnym. Obejmuje ono wiele kolejnych etapów: izolowanie mikroorganizmów, rozrywanie błon i ścian komórkowych w procesie lizy, ekstrakcję i oczyszczanie DNA, a następnie przygotowanie materiału genetycznego w postaci fragmentów możliwych do odczytania przez sekwenator.
Obecnie stosowane metody mogą wymagać od ośmiu do dziesięciu godzin bezpośredniej pracy personelu oraz nawet 16 godzin oczekiwania na zakończenie poszczególnych etapów. Błąd popełniony w trakcie procedury może oznaczać konieczność powtórzenia całego procesu.
Automatyzacja przygotowania próbek
Proces Pathogen2Read obejmuje przygotowanie testu, dedykowane oprogramowanie oraz specjalnie opracowaną mieszaninę enzymów. Rozwiązanie umożliwia wykorzystanie niewielkiego, stołowego urządzenia do automatycznego pipetowania i obsługi cieczy.
Maszyna może samodzielnie przeprowadzić wszystkie najważniejsze etapy przygotowania próbek DNA: lizę komórek, ekstrakcję materiału genetycznego oraz przygotowanie bibliotek do sekwencjonowania.
Naukowcom udało się skrócić czas wymagający bezpośredniego zaangażowania operatora z niemal całego dnia roboczego do mniej niż 45 minut. Po umieszczeniu surowych próbek i odczynników na pojedynczej płytce system automatycznie realizuje pozostałe etapy w ciągu około sześciu godzin. Wynikiem są oczyszczone biblioteki DNA gotowe do umieszczenia w sekwenatorze.
Najważniejsze parametry procesu
Dlaczego jakość bibliotek DNA ma znaczenie
Jakość uzyskanych bibliotek DNA ma podstawowe znaczenie dla wiarygodności sekwencjonowania, szczególnie wtedy, gdy analiza ma wykryć niewielkie mutacje występujące w genomie badanego szczepu bakterii.
Jeżeli poszukuje się niewielkich mutacji, które mogą być związane na przykład z opornością na leki, łatwo je przeoczyć, gdy nie zostaną uchwycone wszystkie sekwencje. Dlatego jakość przygotowania próbki ma zasadnicze znaczenie.
Niepełna lub nierównomierna reprezentacja DNA w bibliotece może utrudniać wykrywanie wariantów genetycznych. Może także obniżyć jakość porównań pomiędzy izolatami oraz ograniczyć możliwość prawidłowego określenia, czy poszczególne przypadki zachorowań są ze sobą epidemiologicznie powiązane.
Skuteczniejsze wykrywanie bakterii Gram-dodatnich
Według Kathryn Whitehead kluczowym elementem systemu jest mieszanina enzymatyczna, która umożliwia szybkie i skuteczne rozbijanie komórek różnych rodzajów bakterii.
Bakterie można podzielić na dwie podstawowe grupy strukturalne: Gram-ujemne i Gram-dodatnie. Bakterie Gram-dodatnie mają grubą warstwę peptydoglikanu w ścianie komórkowej, przez co ich skuteczna liza i pozyskanie DNA mogą być trudniejsze niż w przypadku wielu bakterii Gram-ujemnych.
Jeżeli procedura przygotowania próbki nie doprowadzi do odpowiedniego rozbicia komórek Gram-dodatnich, ich materiał genetyczny może być niedostatecznie reprezentowany w przygotowanej bibliotece. W skrajnych przypadkach obecność takich bakterii w próbce może zostać przeoczona.
Badacze wykazali, że zastosowana mieszanina enzymów poprawiała odzysk DNA bakterii Gram-dodatnich niemal 2,5-krotnie w porównaniu ze standardowymi metodami. Jednocześnie czas oczekiwania związany z tym etapem skrócono z 16 godzin do około 30 minut.
Możliwe zastosowanie w nadzorze epidemiologicznym
Naukowcy mają nadzieję, że Pathogen2Read usprawni monitorowanie ognisk zachorowań i zapobieganie ich rozprzestrzenianiu. Jednym z najważniejszych potencjalnych zastosowań systemu jest umożliwienie mniejszym, lokalnym laboratoriom zdrowia publicznego wykonywania wysokiej jakości analiz genomowych bez konieczności posiadania rozbudowanej infrastruktury automatyzacyjnej.
Standaryzacja przygotowania próbek może również ograniczyć ryzyko błędów manualnych oraz zmniejszyć różnice pomiędzy wynikami uzyskiwanymi przez poszczególne laboratoria. W przypadku sieci nadzoru epidemiologicznego spójność procedur ma szczególne znaczenie, ponieważ dane pochodzące z wielu ośrodków są następnie porównywane i analizowane łącznie.
Jesteśmy szczególnie podekscytowani tym rozwiązaniem, ponieważ od początku opracowywano je z myślą o zastosowaniu w rzeczywistych warunkach. Współpraca z FDA oraz możliwość uwzględnienia opinii i wymagań tej instytucji pozwoliły nam stworzyć metodę, która rzeczywiście może być stosowana i nie ma części ograniczeń obserwowanych niekiedy podczas przechodzenia od badań akademickich do zastosowań praktycznych.
Autorzy podkreślają zatem translacyjny charakter projektu. Metoda nie była rozwijana wyłącznie jako rozwiązanie eksperymentalne, lecz z uwzględnieniem wymagań instytucji prowadzących rzeczywisty nadzór nad patogenami i ogniskami chorób.
Znaczenie dla laboratoriów zdrowia publicznego
Pathogen2Read może być szczególnie przydatny w laboratoriach, w których ograniczona liczba pracowników utrudnia wykonywanie wieloetapowych procedur przygotowania próbek. Automatyzacja mogłaby pozwolić personelowi skoncentrować się na interpretacji wyników, kontroli jakości oraz działaniach epidemiologicznych zamiast na wielogodzinnych czynnościach pipetowania.
Włączenie większej liczby laboratoriów lokalnych do sieci sekwencjonowania genomowego mogłoby skrócić drogę od pobrania próbki do identyfikacji patogenu i porównania go z innymi izolatami. Ma to znaczenie między innymi w przypadku ognisk zakażeń pokarmowych, w których szybkie powiązanie przypadków z określonym produktem lub źródłem narażenia może ograniczyć liczbę kolejnych zachorowań.
Źródło: BMC Genomics, „Pathogen to read: a rapid, automated workflow for public health-ready microbial sequencing”.
DOI: https://doi.org/10.1186/s12864-026-13075-1
