Naukowcy wyjaśnili, jak bakterie wciągają DNA zawierające geny antybiotykooporności

Naukowcy z Indiana University Bloomington opisali mechanizm molekularny, dzięki któremu bakterie mogą z dużą siłą wciągać swoje powierzchniowe włókna, określane jako pile typu IV. Struktury te umożliwiają drobnoustrojom przyleganie do tkanek, tworzenie biofilmów oraz pobieranie DNA ze środowiska, w tym materiału genetycznego zawierającego geny oporności na antybiotyki. Wyniki badania mogą pomóc w opracowaniu metod ograniczających poziomy transfer genów i zdolność bakterii do wywoływania zakażeń.

W artykule:

• Jak pile typu IV wspomagają chorobotwórczość bakterii
• W jaki sposób bakterie pobierają DNA ze środowiska
• Jak współpracują białka motoryczne PilT i PilU
• Co wykazały modele AlphaFold 3 i symulacje dynamiki molekularnej
• Jak doświadczenia laboratoryjne potwierdziły przewidywany mechanizm
• Czy odkrycie może pomóc w ograniczaniu antybiotykooporności

Antybiotykooporność wspierana przez wyjątkową budowę bakterii

Każdego roku zakażenia bakteryjne, które przestały odpowiadać na dostępne antybiotyki, prowadzą do śmierci ponad miliona osób na świecie. W wielu przypadkach trudności w zwalczaniu tych drobnoustrojów wynikają z ich wyjątkowo skutecznej budowy i zdolności do szybkiego przystosowywania się do zmieniających się warunków środowiska.

Na powierzchni wielu bakterii chorobotwórczych znajdują się włókna tysiące razy cieńsze od ludzkiego włosa. Działają one jak biologiczne haki lub liny z kotwicą. Pomagają bakteriom przyczepiać się do tkanek organizmu, tworzyć biofilmy, czyli lepkie i zwarte społeczności bakteryjne, do których antybiotyki oraz elementy układu odpornościowego mogą przenikać z dużą trudnością, a także wychwytywać fragmenty DNA obecne w otoczeniu.

Pobierany materiał genetyczny może zawierać geny zwiększające zdolność bakterii do przetrwania, kolonizowania nowych środowisk lub opierania się działaniu leków przeciwdrobnoustrojowych.

Pile typu IV – mikroskopijne włókna o ogromnej sile

Naukowcy z College of Arts and Sciences at Indiana University Bloomington, współpracujący z badaczami z Dartmouth College i Georgia Institute of Technology, wyjaśnili jeden z kluczowych mechanizmów działania tych bakteryjnych włókien.

W badaniu opublikowanym w Proceedings of the National Academy of Sciences opisano molekularne podstawy jednego z najsilniejszych ruchów mechanicznych obserwowanych w świecie organizmów żywych – wciągania cienkich włókien powierzchniowych nazywanych pilami typu IV, określanymi również skrótem T4P, od angielskiego type IV pili.

Pile typu IV są podobnymi do biczy włóknami wysuwającymi się z powierzchni wielu gatunków bakterii. Po związaniu odpowiedniego celu mogą zostać gwałtownie wciągnięte do komórki. Proces ten generuje siłę wyjątkowo dużą w stosunku do mikroskopijnych rozmiarów całego układu.

Zdolność do wysuwania i retrakcji pili ma zasadnicze znaczenie dla wielu zachowań bakterii, w tym przylegania do powierzchni, poruszania się po nich, rozpoznawania otoczenia, formowania biofilmów oraz pobierania zewnątrzkomórkowego DNA.

Znaczenie pili w zakażeniach człowieka

Poszczególne gatunki bakterii wykorzystują pile typu IV na różnych etapach kolonizacji organizmu gospodarza.

Gdy Pseudomonas aeruginosa zakaża płuca pacjenta z mukowiscydozą, pile pomagają bakterii uchwycić się nabłonka dróg oddechowych i utrzymać w miejscu pomimo działania mechanizmów oczyszczania śluzowo-rzęskowego. Zdolność do adhezji i tworzenia biofilmu jest jednym z czynników sprzyjających przewlekłemu charakterowi zakażeń wywoływanych przez ten patogen.

W przypadku Neisseria gonorrhoeae, bakterii wywołującej rzeżączkę, pile wspomagają przyleganie drobnoustroju do komórek układu moczowo-płciowego, kolonizację błon śluzowych i namnażanie.

Z kolei Vibrio cholerae, bakteria odpowiedzialna za cholerę i będąca głównym organizmem modelowym w omawianym badaniu, może wykorzystywać pile do wychwytywania fragmentów DNA obecnych w środowisku. Mechanizm przypomina działanie wędki: pilus wysuwa się na zewnątrz, wiąże materiał genetyczny, a następnie zostaje wciągnięty w kierunku powierzchni komórki.

Poziomy transfer genów przyspiesza rozprzestrzenianie oporności

Pobieranie DNA ze środowiska stanowi element procesu określanego jako poziomy transfer genów. W odróżnieniu od pionowego przekazywania informacji genetycznej z komórki macierzystej do potomnej poziomy transfer genów umożliwia wymianę materiału genetycznego pomiędzy bakteriami, które nie muszą pozostawać ze sobą w bezpośredniej relacji genealogicznej.

Jedną z dróg poziomego transferu genów jest transformacja naturalna, podczas której bakteria pobiera wolne DNA z otoczenia. Materiał ten może pochodzić między innymi z martwych lub uszkodzonych komórek innych bakterii. Jeżeli fragment DNA zostanie przetransportowany do wnętrza komórki i prawidłowo włączony do jej genomu, bakteria może uzyskać nowe cechy.

W ten sposób drobnoustroje nie zawsze muszą samodzielnie wykształcać oporność w wyniku kolejnych mutacji i działania presji selekcyjnej. Mogą pozyskać już istniejące warianty genów oporności od innych bakterii.

Poziomy transfer genów jest zatem jednym z istotnych mechanizmów napędzających globalne rozprzestrzenianie antybiotykooporności. Nie oznacza to jednak, że każdy pobrany fragment DNA zostanie wykorzystany ani że każdy transfer automatycznie prowadzi do powstania klinicznie istotnej oporności. Konieczne są odpowiednie warunki umożliwiające transport DNA, jego stabilne utrzymanie lub integrację z genomem oraz ekspresję pozyskanych genów.

Dwa silniki molekularne napędzają retrakcję pili

Badacze wiedzieli już wcześniej, że skuteczne wciągnięcie pilusa wymaga współpracy dwóch białek motorycznych znajdujących się wewnątrz komórki bakteryjnej – PilT i PilU. Oba należą do ATPaz, czyli enzymów wykorzystujących energię uwalnianą podczas hydrolizy adenozynotrifosforanu, ATP.

Nie było jednak jasne, dlaczego do generowania dużej siły potrzebne są oba białka oraz w jaki sposób ich aktywność jest koordynowana na poziomie molekularnym.

„Te niewielkie silniki molekularne należą do najsilniejszych w przyrodzie. Zrozumienie, w jaki sposób koordynują swoją aktywność, aby osiągnąć tak dużą siłę, jest celem, do którego naukowcy zajmujący się tą dziedziną dążyli od dawna” – powiedziała Abigail Teipen, pierwsza autorka badania i doktorantka w Department of Biology w College of Arts and Sciences at Indiana University Bloomington.

Aby rozwiązać tę zagadkę, autorzy badania wykorzystali AlphaFold 3 – narzędzie umożliwiające przewidywanie przestrzennej organizacji białek oraz sposobów, w jakie mogą one tworzyć kompleksy.

Zespół modelował wzajemne oddziaływania pomiędzy PilT, PilU i trzecim białkiem nazywanym PilC. PilC stanowi element platformy łączącej układ napędowy z maszynerią odpowiedzialną za budowę i retrakcję pilusa.

PilT pełni funkcję łącznika, a PilU zwiększa siłę układu

Modele wykazały wyraźny podział funkcji pomiędzy badanymi białkami. PilT jest podstawowym elementem łączącym układ motoryczny z maszynerią pilusa poprzez kontakt z PilC. Jednocześnie PilT umożliwia przyłączenie PilU, które nie może samodzielnie związać się z aparatem retrakcyjnym w odpowiednim położeniu.

Po utworzeniu kompleksu heksameryczne struktury PilT i PilU układają się jedna nad drugą. Charakterystyczny fragment C-końcowy PilU obejmuje PilT w sposób przypominający dłoń zaciskającą się na uchwycie. Taka architektura może pozwalać obu silnikom na pracę jako funkcjonalnie zsynchronizowana jednostka.

Naukowcy przeprowadzili również symulacje dynamiki molekularnej, czyli obliczeniowe odwzorowanie ruchu atomów i zmian konformacyjnych zachodzących w kompleksie białkowym. Symulacje obejmujące setki nanosekund pozwoliły obserwować, jak PilT i PilU oddziałują ze sobą w czasie, oraz wskazać konkretne kontakty molekularne stabilizujące połączenie obu białek.

Modele komputerowe potwierdzono eksperymentalnie

Przewidywania uzyskane za pomocą AlphaFold 3 i symulacji dynamiki molekularnej zostały następnie zweryfikowane w doświadczeniach laboratoryjnych. Badacze celowo zmieniali wybrane aminokwasy tworzące miejsca kontaktu pomiędzy PilT i PilU, a następnie obserwowali wpływ tych modyfikacji na zachowanie bakterii.

Przerwanie połączenia PilT–PilU nie prowadziło bezpośrednio do śmierci komórek bakteryjnych. Uniemożliwiało jednak skuteczne wciąganie DNA w warunkach, w których prawidłowo zbudowany aparat pili przeprowadzał ten proces.

„Wyniki pokazują, że nie chodzi wyłącznie o obecność dwóch silników, ale o sposób, w jaki fizycznie ze sobą oddziałują i koordynują swoją pracę. Jeżeli uda się znaleźć metody zakłócające tę koordynację, możemy uzyskać nową drogę ograniczania rozprzestrzeniania przez bakterie genów oporności na antybiotyki oraz utrudniania im ustanawiania zakażeń” – wyjaśnił Ankur Dalia, profesor biologii i starszy autor badania.

Siła większa niż może wytworzyć pojedynczy silnik

Autorzy obliczyli, że pojedyncze białko motoryczne powinno być zdolne do generowania siły wynoszącej około 50 pikoniutonów. Pikoniuton jest niezwykle małą jednostką z perspektywy makroskopowej, jednak w odniesieniu do struktur molekularnych i komórkowych oznacza znaczną siłę.

Pomiary wykonane wcześniej w żywych bakteriach wskazywały jednak, że pile mogą ciągnąć z siłą ponad dwukrotnie większą. Wyniki nowego badania sugerują, że fragment C-końcowy PilU, obejmujący kompleks PilT, może umożliwiać synchronizację cykli energetycznych obu ATPaz.

Dzięki temu PilT i PilU mogą wspólnie generować siłę, której żaden z tych silników nie osiągnąłby samodzielnie. Nie jest to zatem jedynie proste sumowanie aktywności dwóch enzymów, lecz skoordynowany mechanizm mechanochemiczny wymagający prawidłowego kontaktu między białkami.

Mechanizm zachowany u odlegle spokrewnionych bakterii

Jednym z istotnych wyników badania było wykazanie, że opisany mechanizm koordynacji nie jest charakterystyczny wyłącznie dla bakterii cholery.

Ten sam kluczowy kontakt molekularny zidentyfikowano u Acinetobacter baylyi, gatunku odlegle spokrewnionego z Vibrio cholerae. Doświadczenia potwierdziły, że oddziaływanie PilT–PilU jest u tego mikroorganizmu potrzebne do prawidłowej retrakcji pili typu IV.

Analiza sekwencji białkowych wskazała ponadto, że elementy odpowiedzialne za koordynację silników są szeroko zachowane u wielu bakterii, w tym gatunków chorobotwórczych takich jak Pseudomonas aeruginosa i Legionella pneumophila. Drugi z tych drobnoustrojów jest czynnikiem etiologicznym legionelozy, w tym jej ciężkiej postaci przebiegającej jako zapalenie płuc, określanej jako choroba legionistów.

Szerokie zachowanie tego mechanizmu w ewolucji sugeruje, że strategia współpracy PilT i PilU pojawiła się stosunkowo wcześnie i została utrzymana ze względu na jej znaczenie dla funkcjonowania różnych systemów pili typu IV.

Potencjalny cel przyszłych strategii przeciwdrobnoustrojowych

Odkrycie nie oznacza jeszcze opracowania nowego antybiotyku ani gotowej terapii blokującej rozprzestrzenianie genów oporności. Badanie miało charakter mechanistyczny i obejmowało modelowanie strukturalne, symulacje komputerowe oraz doświadczenia na bakteriach.

Wyniki wskazują jednak na potencjalny punkt uchwytu dla przyszłych strategii przeciwdrobnoustrojowych. Cząsteczki zakłócające kontakt PilT–PilU mogłyby teoretycznie osłabiać zdolność bakterii do generowania silnej retrakcji pili, pobierania DNA, przylegania do powierzchni lub realizowania innych procesów zależnych od pili typu IV.

Takie podejście nie musiałoby bezpośrednio zabijać bakterii. Mogłoby natomiast ograniczać określone cechy związane z ich chorobotwórczością i adaptacją. Konieczne są jednak dalsze badania, aby ustalić, czy interfejs PilT–PilU można skutecznie i selektywnie blokować, czy mechanizm ten działa analogicznie w warunkach zakażenia oraz czy jego zahamowanie rzeczywiście ogranicza poziomy transfer genów oporności w złożonych społecznościach bakteryjnych.

Wnioski

Badanie wyjaśnia, w jaki sposób dwa bakteryjne białka motoryczne – PilT i PilU – tworzą skoordynowany układ zdolny do generowania wyjątkowo dużej siły retrakcji pili typu IV. PilT łączy silnik z maszynerią pilusa i pozycjonuje PilU, natomiast C-końcowy fragment PilU stabilizuje kontakt obu ATPaz i prawdopodobnie umożliwia synchronizację ich cykli energetycznych.

Zakłócenie tego połączenia ograniczało zdolność bakterii do wciągania DNA. Ponieważ mechanizm jest zachowany u różnych gatunków, w tym patogenów istotnych klinicznie, może w przyszłości stać się przedmiotem badań nad metodami ograniczającymi chorobotwórczość bakterii oraz rozprzestrzenianie genów antybiotykooporności.

Badanie zostało sfinansowane przez National Institutes of Health.

Źródło: Proceedings of the National Academy of Sciences, „Structural modeling reveals the mechanism of motor ATPase coordination during type IV pilus retraction”.
DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2531253123