Porównanie testów wrażliwości na bakteriofagi w 508 izolatach Pseudomonas aeruginosa od chorych na mukowiscydozę

Standaryzacja oznaczania wrażliwości bakterii na bakteriofagi pozostaje jednym z istotnych wyzwań rozwoju fagoterapii. W badaniu opublikowanym 27 października 2026 roku na łamach „Journal of Clinical Microbiology” porównano dwie metody oceny wrażliwości 508 izolatów Pseudomonas aeruginosa uzyskanych od uczestników randomizowanego badania klinicznego z mukowiscydozą. Czterofagowy koktajl WRAIR-PAM-CF1 wykazywał aktywność wobec 33% izolatów w metodzie płytkowej i 38% w metodzie płynnej. Mimo wysokiej zgodności obu metod autorzy wskazują na konieczność dalszej standaryzacji testowania oraz opracowania kryteriów interpretacyjnych.

Cel badania, autorzy i ośrodki naukowe

Rozwój terapii wykorzystujących bakteriofagi wymaga metod laboratoryjnych pozwalających oceniać aktywność określonych fagów wobec izolatów bakteryjnych. W przeciwieństwie do konwencjonalnych testów lekowrażliwości bakterii, dla których opracowano ustandaryzowane procedury, oznaczanie wrażliwości na bakteriofagi (ang. phage susceptibility testing, PST) nie dysponuje obecnie powszechnie przyjętymi metodami referencyjnymi ani klinicznie zwalidowanymi kryteriami interpretacji wyników.

Problem ten ma szczególne znaczenie przy opracowywaniu wielofagowych preparatów terapeutycznych. Poszczególne bakteriofagi mogą wykazywać odmienną aktywność wobec tego samego izolatu, a wyniki uzyskiwane dla mieszaniny fagów nie muszą być w pełni zgodne z wynikami testowania jej składników oddzielnie.

W publikacji zatytułowanej Comparative plaque- and liquid-based phage susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates in a cystic fibrosis randomized clinical trial badacze przeanalizowali zgodność dwóch metod PST wykorzystanych do oceny izolatów Pseudomonas aeruginosa uzyskanych od uczestników badania klinicznego ARLG PHAGE.

Praca ukazała się 27 października 2026 roku w czasopiśmie Journal of Clinical Microbiology, wydawanym przez American Society for Microbiology.

Autorzy i afiliacje

Pierwszą autorką publikacji jest Christina A. Koscianski z Division of Clinical Microbiology, Department of Laboratory Medicine and Pathology, Mayo Clinic w Rochester. Autorką korespondencyjną jest Robin Patel, reprezentująca Mayo Clinic.

W gronie autorów znaleźli się również Wanying Shao, Lauren Komarow, Krupa Parmar, Kerryl E. Greenwood-Quaintance, Maria Souli, Mikeljon P. Nikolich, Andrey A. Filippov, Robert T. Schooley, Scott R. Evans, David Pride, Daria Van Tyne, Henry F. Chambers, Vance G. Fowler Jr. oraz Pranita D. Tamma. Pracę przygotowano w imieniu Antibacterial Resistance Leadership Group.

W badaniu uczestniczyli naukowcy związani między innymi z Mayo Clinic, The George Washington University, Duke Clinical Research Institute, Walter Reed Army Institute of Research, UC San Diego, University of Pittsburgh, University of California, San Francisco oraz University of Pennsylvania Perelman School of Medicine.

Powiązanie z randomizowanym badaniem klinicznym

Materiał bakteryjny pochodził z wieloośrodkowego badania klinicznego ARLG PHAGE (NCT05453578), prowadzonego w fazie 1b/2, z randomizacją, podwójnym zaślepieniem i kontrolą placebo. W badaniu tym oceniano pojedyncze dożylne podanie czterofagowego koktajlu WRAIR-PAM-CF1 osobom z mukowiscydozą, u których stwierdzano obecność P. aeruginosa.

Należy rozróżnić dwa poziomy analizy: badanie ARLG PHAGE miało charakter interwencyjnego badania klinicznego, natomiast omawiana publikacja przedstawia laboratoryjne porównanie metod oceny wrażliwości wyizolowanych bakterii. Nie jest raportem dotyczącym skuteczności klinicznej fagoterapii.

Materiał badawczy i porównywane metody laboratoryjne

Pochodzenie materiału bakteryjnego

Do analizy początkowo zakwalifikowano 511 izolatów P. aeruginosa uzyskanych z plwociny uczestników badania klinicznego. Trzy izolaty wykluczono ze względu na niewystarczający wzrost bakteryjny uniemożliwiający wiarygodną ocenę wrażliwości obiema metodami.

Ostateczna analiza objęła 508 izolatów bakteryjnych.

Próbki plwociny pobierano przed podaniem bakteriofagów lub placebo oraz dwie godziny po podaniu, a także podczas kolejnych wizyt kontrolnych. Oznacza to, że analizowany zbiór obejmował izolaty pochodzące z różnych momentów obserwacji, w tym wielokrotne izolaty od tych samych uczestników.

Materiał pochodził z 17 ośrodków uczestniczących w badaniu klinicznym. Próbki przekazywano do University of California San Diego, gdzie przeprowadzano izolację P. aeruginosa. Identyfikację gatunkową wykonywano z wykorzystaniem spektrometrii mas MALDI-TOF. Następnie izolaty przechowywano w temperaturze -80°C i przekazywano do Mayo Clinic w Rochester w celu wykonania testów wrażliwości na bakteriofagi.

W przypadku występowania kilku morfologicznie odmiennych kolonii P. aeruginosa w jednej próbce poszczególne morfotypy analizowano oddzielnie.

Charakterystyka badanego koktajlu bakteriofagowego

Badano aktywność czterech bakteriofagów:

• PaWRA01Φ11,
• PaWRA01Φ39,
• PaWRA02Φ83,
• PaWRA02Φ87.

Wszystkie cztery wchodziły w skład koktajlu WRAIR-PAM-CF1. Koktajl przygotowywano przed każdą serią testów, mieszając poszczególne fagi w proporcji 1:1:1:1.

Preparaty fagowe oraz szczepy gospodarzy służące do ich namnażania dostarczała firma Adaptive Phage Therapeutics.

Metoda płytkowa (plaque assay)

Pierwszą z porównywanych technik była metoda płytkowa (ang. plaque assay, PA), oparta na obserwacji aktywności bakteriofagów wobec bakterii wzrastających w podłożu agarowym.

Zawiesinę bakteryjną nanoszono do warstwy agaru, a następnie aplikowano kolejne dziesięciokrotne rozcieńczenia badanego faga lub koktajlu fagowego. Po inkubacji oceniano obszary przejaśnienia i charakter obserwowanych łysinek fagowych.

Aktywność oceniano w pięciostopniowej skali od 0 do 4:

• 0: brak obserwowanej lizy lub aktywności fagowej;
• 1: bardzo słabe przejaśnienia przy niskich rozcieńczeniach, bez policzalnych łysinek;
• 2: przejaśnienia lub mętne obszary z drobnymi łysinkami;
• 3: wyraźne przejaśnienia z łysinkami małej lub średniej wielkości przy wysokich rozcieńczeniach;
• 4: duże, wyraźne łysinki występujące przy wysokich rozcieńczeniach fagów.

Wyniki od 0 do 1 klasyfikowano jako brak wrażliwości, natomiast od 2 do 4 jako wrażliwość izolatu na dany bakteriofag.

Metoda płynna z wykorzystaniem Biolog Omnilog

Drugą metodą był test płynny (ang. liquid assay, LA), wykorzystujący system Biolog Omnilog do monitorowania aktywności metabolicznej bakterii w obecności bakteriofagów.

Badanie prowadzono na 96-dołkowych płytkach z wykorzystaniem podłoża zawierającego barwnik tetrazoliowy. Końcowe stężenie badanego faga lub koktajlu wynosiło 1 × 10⁶ PFU/ml, a bakterii 1 × 10⁵ CFU/ml.

Aktywność metaboliczną rejestrowano co 15 minut przez 48 godzin. Wyniki analizowano za pomocą oprogramowania PhageSelect, które pozwalało wyznaczyć czas zahamowania wzrostu bakteryjnego w obecności bakteriofaga w porównaniu z kontrolą bez faga, określany jako hold time.

Przyjęto następujące kryteria:

• czas zahamowania wzrostu poniżej 4 godzin – izolat niewrażliwy;
• czas zahamowania wzrostu wynoszący co najmniej 4 godziny – izolat wrażliwy.

Autorzy zaznaczyli, że zastosowana granica czterech godzin nie stanowi klinicznie zwalidowanego punktu odcięcia. Została przyjęta na podstawie wcześniejszych prac metodologicznych.

Kontrola zgodności wyników

Obydwa testy wykonywano tego samego dnia, wykorzystując te same zawiesiny bakteryjne i preparaty fagowe.

Jeśli początkowe wyniki PA i LA były zgodne, nie wykonywano dodatkowych oznaczeń. Jeżeli występowała rozbieżność, przeprowadzano dwie kolejne serie testów obiema metodami, w dwóch odrębnych dniach.

Wynik końcowy każdej metody ustalano na podstawie zgodności co najmniej dwóch spośród trzech oznaczeń.

Wrażliwość izolatów na pojedyncze bakteriofagi i koktajl WRAIR-PAM-CF1

Badacze ocenili odsetek izolatów zakwalifikowanych jako wrażliwe na każdy z czterech fagów osobno oraz na ich mieszaninę. W publikacji parametr ten określano jako coverage, czyli odsetek izolatów wykazujących wrażliwość w warunkach laboratoryjnych.

Po rozstrzygnięciu początkowych rozbieżności między metodami koktajl czterech bakteriofagów wykazywał najwyższy odsetek wrażliwych izolatów spośród wszystkich badanych preparatów.

W metodzie płytkowej wrażliwość na WRAIR-PAM-CF1 stwierdzono u 170 z 508 izolatów (33%), natomiast w metodzie płynnej u 195 z 508 izolatów (38%).

Porównanie poszczególnych bakteriofagów

Najwyższą aktywność spośród pojedynczych fagów wykazywał PaWRA02Φ83. W metodzie płytkowej za wrażliwe uznano 164 izolaty (32%), a w metodzie płynnej 188 izolatów (37%).

Drugim pod względem odsetka wrażliwych izolatów był PaWRA02Φ87, dla którego wartości wynosiły odpowiednio 20% i 21%.

Najniższy odsetek wrażliwych izolatów stwierdzono dla PaWRA01Φ39, odpowiednio 4% i 5%.

Dane przedstawiają końcowe wyniki oznaczeń wrażliwości. Źródło danych: tabela 1 oryginalnej publikacji w Journal of Clinical Microbiology.

Choć koktajl zapewniał liczbowo szerszy zakres aktywności niż każdy z pojedynczych bakteriofagów, ponad połowa analizowanych izolatów nie została zakwalifikowana jako wrażliwa na WRAIR-PAM-CF1 w żadnej z dwóch metod.

Czy wynik testu koktajlu odpowiadał aktywności jego składników?

Autorzy przeanalizowali również, w jakim stopniu wynik uzyskany dla mieszaniny bakteriofagów odpowiadał wynikom testowania jej poszczególnych składników.

Wśród izolatów zakwalifikowanych jako wrażliwe na koktajl metodą płytkową 169 ze 170 (99%) wykazywało również wrażliwość na co najmniej jeden z czterech fagów badanych oddzielnie.

W metodzie płynnej analogiczną zgodność uzyskano dla 187 ze 195 izolatów (96%).

Zaobserwowano jednak także sytuacje, w których izolat uznawano za wrażliwy na koktajl, mimo braku wrażliwości na wszystkie pojedyncze fagi. W końcowych oznaczeniach dotyczyło to jednego izolatu w PA oraz ośmiu w LA.

Odwrotną sytuację, czyli wrażliwość na przynajmniej jeden pojedynczy bakteriofag przy jednoczesnej niewrażliwości na koktajl, odnotowano dla sześciu izolatów w PA i dziewiętnastu w LA.

Według autorów wyniki testowania koktajlu w większości odzwierciedlały łączną aktywność jego składników, jednak nie były z nią całkowicie tożsame.

Zgodność metod płytkowej i płynnej

Jednym z głównych zagadnień analizowanych w publikacji była zgodność wyników dwóch odmiennych metod oznaczania wrażliwości fagowej.

Badacze porównali zarówno wyniki pierwszego oznaczenia, jak i wyniki końcowe, uzyskane po ponownym zbadaniu izolatów, dla których początkowo stwierdzono rozbieżności.

Powtórzenie oznaczeń zwiększało zgodność

Dla koktajlu WRAIR-PAM-CF1 początkowa zgodność klasyfikacji wynosiła 81%, co odpowiadało 412 spośród 508 izolatów.

Po dodatkowych oznaczeniach rozbieżnych próbek zgodność wzrosła do 90% (459/508).

W przypadku poszczególnych bakteriofagów końcowa zgodność metod wynosiła od 93% do 99%.

Dane pochodzą z tabeli 3 oryginalnej publikacji. Zgodność oznacza identyczną klasyfikację izolatu jako wrażliwego lub niewrażliwego w obu metodach.

W przypadku koktajlu po zakończeniu dodatkowego testowania 158 izolatów zakwalifikowano jako wrażliwe obiema metodami, natomiast 301 jako niewrażliwe obiema metodami.

Rozbieżności utrzymywały się dla 49 izolatów. Wśród nich 12 było wrażliwych wyłącznie w metodzie płytkowej, a 37 wyłącznie w metodzie płynnej.

Zgodność wyników dodatnich i ujemnych

Autorzy obliczyli dwa dodatkowe wskaźniki: procentową zgodność wyników wrażliwych (ang. susceptible percent agreement, SPA) oraz procentową zgodność wyników niewrażliwych (ang. non-susceptible percent agreement, NSPA).

Analizy przeprowadzano w obu kierunkach, najpierw traktując metodę płytkową jako test odniesienia, a następnie metodę płynną.

Gdy metodę płytkową przyjmowano jako odniesienie, końcowa zgodność wyników wrażliwych wynosiła 88-100%, a wyników niewrażliwych 89-99%, w zależności od badanego faga lub koktajlu.

Przy odwrotnej konfiguracji, kiedy metodą odniesienia była LA, końcowa zgodność wyników wrażliwych wynosiła 76-84%, natomiast wyników niewrażliwych 96-100%.

Dla koktajlu WRAIR-PAM-CF1, przy zastosowaniu PA jako testu odniesienia, końcowa SPA wynosiła 93% (95% CI: 88-96%), natomiast NSPA 89% (95% CI: 85-92%).

Przy przyjęciu LA jako testu odniesienia wartości te wynosiły odpowiednio 81% (95% CI: 75-86%) i 96% (95% CI: 93-98%).

Różnice wrażliwości pomiędzy morfotypami Pseudomonas aeruginosa

Istotnym elementem analizy była ocena izolatów o odmiennej morfologii kolonii pochodzących z tej samej próbki plwociny.

W badanym materiale zidentyfikowano 106 próbek plwociny zawierających dwa morfotypy P. aeruginosa oraz 16 próbek, w których stwierdzano trzy morfotypy.

Wśród 106 par izolatów reprezentujących pierwszy i drugi morfotyp tylko 46 par (43%) wykazywało taki sam profil wyników PST.

Wśród tych 46 zgodnych par w 35 przypadkach (76%) oba morfotypy były niewrażliwe na wszystkie pojedyncze fagi i koktajl w końcowych oznaczeniach obiema metodami.

W pozostałych 11 zgodnych parach, w których wykazano wrażliwość fagową, wszystkie izolaty były wrażliwe na PaWRA02Φ83 oraz koktajl WRAIR-PAM-CF1 w obu metodach. W sześciu spośród tych jedenastu par stwierdzono również wrażliwość na PaWRA02Φ87.

W próbkach zawierających trzy morfotypy także obserwowano różnice w profilach wrażliwości. Autorzy opisali między innymi przypadki współwystępowania morfotypów uznanych za wrażliwe i niewrażliwe na badane bakteriofagi.

Wyniki wskazują, że morfologicznie odmienne izolaty P. aeruginosa pochodzące z jednej próbki plwociny mogą różnić się profilem aktywności badanych fagów. Autorzy nie przeprowadzili jednak analizy klonalności, dlatego na podstawie przedstawionych danych nie można przesądzać o genetycznej odrębności wszystkich porównywanych izolatów.

Ograniczenia badania i znaczenie uzyskanych wyników

W dyskusji autorzy wskazali, że uzyskane dane mają znaczenie przede wszystkim dla dalszego rozwoju i standaryzacji metod laboratoryjnego oznaczania wrażliwości bakterii na bakteriofagi.

Metoda płytkowa jest szeroko wykorzystywana w testowaniu aktywności fagowej, jednak wymaga pracy manualnej i wizualnej oceny wyników. Może to utrudniać jej zastosowanie w rutynowych laboratoriach klinicznych na większą skalę.

Metody płynne, umożliwiające jednoczesną analizę większej liczby próbek oraz monitorowanie zmian aktywności metabolicznej bakterii, stanowią potencjalne rozwiązanie dla testowania wysokoprzepustowego. Wykazana zgodność obu technik jest istotną przesłanką dla dalszych prac metodologicznych.

Jednocześnie autorzy zwracają uwagę na stosunkowo ograniczony zakres aktywności badanej mieszaniny wobec izolatów pochodzących od uczestników badania klinicznego. W ich ocenie dalszy rozwój fagoterapii u pacjentów z mukowiscydozą może wymagać opracowywania szerszych lub alternatywnych kombinacji bakteriofagów.

Dlaczego nie można bezpośrednio przełożyć wyników na skuteczność fagoterapii?

Wrażliwość oceniana w warunkach laboratoryjnych nie jest równoważna potwierdzonej odpowiedzi na leczenie u pacjenta.

Omawiana publikacja nie analizowała zależności pomiędzy wynikiem PST a odpowiedzią kliniczną na podanie fagów. Nie przedstawiono w niej również analiz zależności PST od wyników sekwencjonowania całogenomowego bakterii ani od konwencjonalnych testów lekowrażliwości na antybiotyki.

Nie można zatem na podstawie przedstawionych danych określić wartości predykcyjnej poszczególnych metod względem klinicznej skuteczności fagoterapii.

Ograniczenia metodologiczne wskazane przez autorów

Finansowanie i ujawnione powiązania autorów

Badanie otrzymało wsparcie National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, w ramach grantu UM1AI104681.

W publikacji przedstawiono również deklaracje dotyczące potencjalnych konfliktów interesów. Część współautorów zgłosiła powiązania doradcze, finansowe lub patentowe z podmiotami rozwijającymi technologie fagowe, w tym Adaptive Phage Therapeutics i BiomX. Szczegółowe deklaracje znajdują się w oryginalnej pracy.

Wnioski autorów

Badacze stwierdzili, że czterofagowy koktajl WRAIR-PAM-CF1 zapewniał liczbowo szerszy zakres aktywności wobec badanych izolatów Pseudomonas aeruginosa niż którykolwiek z pojedynczych bakteriofagów, niezależnie od zastosowanej metody PST.

Wyniki uzyskiwane dla koktajlu w większości odpowiadały łącznym wynikom oznaczeń jego poszczególnych składników, a zgodność między metodami płytkową i płynną była wysoka, zwłaszcza po dodatkowym testowaniu izolatów dających początkowo rozbieżne wyniki.

Jednocześnie mniej niż połowa analizowanych izolatów została uznana za wrażliwą na koktajl, co wskazuje na ograniczony zakres jego aktywności wobec badanej kolekcji bakterii.

Autorzy podkreślają potrzebę dalszego rozwijania standaryzowanych metod PST oraz oceniania, w jakim stopniu laboratoryjne wyniki wrażliwości na bakteriofagi odpowiadają rzeczywistym efektom leczenia.