Utrata antygenu O zmienia ruchliwość, biofilm i lekowrażliwość Pseudomonas aeruginosa

Zmiany ekspresji antygenu O (ang. O-specific antigen, OSA), będącego elementem lipopolisacharydu Pseudomonas aeruginosa, mogą wpływać jednocześnie na ruchliwość bakterii, właściwości powierzchni komórki, rozwój biofilmu, interakcję z komórkami układu odpornościowego i wrażliwość na wybrane antybiotyki. Autorzy pracy opublikowanej w mBio przeanalizowali 144 kliniczne izolaty P. aeruginosa z kladu PA14, a następnie przeprowadzili serię eksperymentów z użyciem izogenicznych mutantów zaburzających biosyntezę OSA. Wyniki wskazują, że konsekwencje zmniejszonej ekspresji OSA są silnie zależne od warunków – cechy mogące sprzyjać przetrwaniu bakterii współistniały z osłabieniem zjadliwości w modelu Galleria mellonella.

Dlaczego badacze analizowali antygen O Pseudomonas aeruginosa?

Pseudomonas aeruginosa jest oportunistycznym patogenem zdolnym do znacznej adaptacji do warunków panujących podczas zakażenia gospodarza. Autorzy pracy zwracają uwagę, że w przewlekłych zakażeniach związanych z biofilmem obserwowane są m.in. zmiany ruchliwości bakterii oraz struktury lipopolisacharydu (LPS).

LPS P. aeruginosa składa się z lipidu A, oligosacharydu rdzeniowego oraz antygenu O. W analizowanym szczepie PA14 antygen O-specyficzny – OSA – występuje w postaci łańcuchów o różnej długości. W izolatach P. aeruginosa pochodzących z przewlekle zakażonych płuc osób z mukowiscydozą utrata OSA jest dobrze opisanym fenotypem, jednak jej funkcjonalne konsekwencje dla przebiegu zakażenia pozostawały nie w pełni wyjaśnione.

Celem badaczy było ustalenie, w jaki sposób ekspresja genów biosyntezy OSA wiąże się z ruchliwością P. aeruginosa oraz czy zmiany struktury OSA wpływają również na inne cechy związane z patogennością, w tym tworzenie biofilmu, podatność na działanie dopełniacza, fagocytozę, cytotoksyczność oraz wrażliwość na antybiotyki.

Autorzy, ośrodki i publikacja

Autorami pracy są Oliver Hartmann, Matthias Preusse, Ann Kathrin Heroven, Sebastian Felgner, Melisa Gür, Adrian Kordes, Victor Wolff Bengtsen, Mohammad Roghanian, Xinxin Zhao, Mathias Müsken, Nicolas Oswaldo Gomez oraz Susanne Häussler.

W badaniu uczestniczyli naukowcy związani z następującymi ośrodkami:

• Department of Molecular Bacteriology, Helmholtz Centre for Infection Research (HZI), Braunschweig, Germany,
• Institute of Molecular Bacteriology, TWINCORE Centre for Experimental and Clinical Infection Research, a joint venture of the Hannover Medical School (MHH) and the HZI, Hannover, Germany,
• Cluster of Excellence RESIST (EXC 2155), Hannover Medical School, Hannover, Germany,
• Department of Clinical Microbiology, Copenhagen University Hospital–Rigshospitalet, Copenhagen, Denmark,
• Institute of Preventive Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan, China,
• Research Center of Avian Diseases, College of Veterinary Medicine, Sichuan Agricultural University, Chengdu, Sichuan, China,
• Key Laboratory of Animal Disease and Human Health of Sichuan Province, Chengdu, Sichuan, China,
• Central Facility for Microscopy, Helmholtz Centre for Infection Research, Braunschweig, Germany.

Publikacja „Role of O-specific antigen expression in Pseudomonas aeruginosa pathogenicity” ukazała się online 5 października 2026 r. w czasopiśmie mBio jako Research Article w formule Open Access.

Jak przeprowadzono badanie?

Analiza 144 klinicznych izolatów

W pierwszej części badania autorzy wykorzystali 144 kliniczne izolaty P. aeruginosa należące do kladu PA14. Oceniali trzy typy ruchliwości bakterii: swimming, swarming i twitching. Izolaty podzielono według obserwowanego fenotypu na nieruchliwe oraz wykazujące małą lub dużą ruchliwość.

Do analizy wykorzystano również wcześniej uzyskane profile transkrypcyjne tych izolatów hodowanych w LB do OD₆₀₀ równego 2. Ekspresję genów porównywano pomiędzy grupami o małej i dużej ruchliwości. Izolaty całkowicie nieruchliwe wyłączono z tej części analizy.

Analizę różnicowej ekspresji genów przeprowadzono w pakiecie edgeR. Za geny o różnicowej ekspresji uznawano te spełniające zastosowane przez autorów kryteria, w tym współczynnik zmiany ekspresji 1,5 oraz FDR ≤0,05.

Mutanty genów biosyntezy OSA

W celu zbadania funkcji poszczególnych genów klastra biosyntezy OSA przygotowano w tle szczepu UCBPP-PA14 mutanty delecyjne obejmujące m.in. wzz, PA14_23400, orfM, orfN, wbpM oraz PA14_66100. Wykorzystano metodę rekombinacji wspomaganej CRISPR-Cas9. Skuteczność delecji weryfikowano za pomocą PCR kolonijnego i sekwencjonowania Sangera, a dla wybranych mutantów przygotowano również szczepy komplementowane chromosomalnie.

Autorzy odnotowali istotny szczegół metodologiczny: podczas rewizji pracy stwierdzono, że pierwotnie przygotowany szczep określany jako ΔorfM, wykorzystywany w części eksperymentów, był w rzeczywistości mutantem ΔorfLM. Kluczowe eksperymenty dotyczące LPS i ruchliwości powtórzono z prawidłowym mutantem ΔorfM, natomiast doświadczenia niepowtórzone zostały w publikacji jednoznacznie oznaczone jako dotyczące ΔorfLM.

Ocena LPS, ruchliwości i powierzchni komórek

Strukturę LPS oceniano po ekstrakcji i rozdziale SDS-PAGE z barwieniem srebrem. Hydrofobowość powierzchni komórek określano w teście microbial adhesion to hydrocarbons (MATH).

Ruchliwość oceniano osobno w testach swimming, swarming i twitching. Aby rozróżnić wpływ OSA na samą funkcję wici od wpływu na zachowanie bakterii na powierzchni, autorzy wykorzystali również mikroskopową analizę prędkości pojedynczych komórek w płynnym środowisku. Obecność wici oceniano za pomocą transmisyjnej i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Biofilm i lekowrażliwość

Rozwój biofilmu oceniano kilkoma metodami: na podłożu z czerwienią Kongo, za pomocą testu z fioletem krystalicznym oraz z wykorzystaniem konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. W analizie CLSM porównywano m.in. biovolume i trójwymiarową architekturę biofilmu po 24 oraz 48 godzinach.

Minimalne stężenia hamujące (MIC) ceftazydymu, tobramycyny, amikacyny i lewofloksacyny oznaczano dwiema metodami: mikrorozcieńczeń w bulionie według wytycznych EUCAST oraz za pomocą pasków gradientowych Etest na podłożu stałym.

Makrofagi i model Galleria mellonella

Do oceny interakcji bakterii z komórkami gospodarza wykorzystano mysie makrofagi RAW264.7. Pobieranie bakterii przez makrofagi oceniano za pomocą testu ochrony gentamycynowej, natomiast cytotoksyczność – na podstawie uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH).

Badania in vivo przeprowadzono w modelu larw Galleria mellonella. W poszczególnych doświadczeniach zakażano równolegle po 20 larw. Analizowano przeżycie gospodarza, obciążenie bakteryjne oraz odpowiedź na amikacynę i ceftazydym. Z hemolimfy zakażonych larw pobranej po 20 godzinach przygotowano również materiał do sekwencjonowania RNA i oceny ekspresji genów bakterii podczas zakażenia.

Ekspresja OSA była związana z ruchliwością i właściwościami powierzchni bakterii

Spośród 144 analizowanych izolatów 96, czyli dwie trzecie, nie wykazywało swarming w zastosowanych warunkach. Z tego powodu dalsza analiza koncentrowała się przede wszystkim na swimming i twitching, dla których obserwowano szerokie zróżnicowanie między izolatami.

Porównanie transkryptomów wykazało 119 genów o różnicowej ekspresji pomiędzy izolatami o małej i dużej aktywności swimming oraz 212 genów różniących izolaty o małej i dużej aktywności twitching. W obu zestawach znalazł się klaster genów związanych z biosyntezą antygenu O LPS. Klaster PA14_23360-PA14_23470 obejmował 12 kolejnych genów.

Zaburzenia OSA zwiększały hydrofobowość powierzchni

Analiza LPS wykazała, że badane mutanty genów biosyntezy OSA nie zawsze całkowicie traciły antygen O. W kilku przypadkach obserwowano przede wszystkim zmianę rozkładu i zmniejszenie liczby krótkich łańcuchów OSA. Komplementacja mutacji przywracała wzorzec OSA typu dzikiego, co wskazywało na bezpośredni związek obserwowanych zmian z odpowiednimi delecjami.

W badaniu odporności na surowicę PA14 typu dzikiego oraz mutant Δwzz zachowywały wysoką przeżywalność, około 60-70%. W przypadku pozostałych analizowanych mutantów przeżywalność po ekspozycji na aktywny układ dopełniacza była niższa niż 0,01%.

Jednocześnie, z wyjątkiem Δwzz, mutanty wykazywały istotnie większą hydrofobowość powierzchni komórki. Wartości mieściły się w zakresie 62-67%, podczas gdy średnia dla PA14 typu dzikiego wynosiła 54%.

Ruchliwość powierzchniowa zmieniała się mimo sprawnych wici

Najważniejszym spostrzeżeniem było rozdzielenie ruchliwości bakterii na powierzchni od samej zdolności wici do napędzania komórki. W mikroskopii elektronowej u badanych mutantów widoczne były prawidłowe, rozciągnięte wici. Także pomiary pojedynczych komórek pływających w środowisku płynnym nie wykazały istotnych różnic prędkości w porównaniu ze szczepem rodzicielskim.

Różnice pojawiały się natomiast w testach wymagających przemieszczania się po lub w obrębie podłoża. Delecje orfM i szczególnie orfN powodowały istotne zmniejszenie swimming, twitching i swarming. Mutant ΔPA14_23400 wykazywał z kolei niewielkie, ale powtarzalne zwiększenie ruchliwości.

W interpretacji autorów zwiększona hydrofobowość komórek przy zaburzonej strukturze OSA sprzyja silniejszemu przywieraniu do powierzchni. Może to ograniczać przemieszczanie się bakterii w testach powierzchniowych mimo zachowania sprawnej wici.

Zmiany architektury i tempa dojrzewania biofilmu

Wpływ zmian OSA na biofilm nie był jednakowy we wszystkich zastosowanych testach. W oznaczeniu z fioletem krystalicznym wszystkie mutanty wytwarzały nieco mniej biofilmu niż PA14 typu dzikiego, a istotne statystycznie zmniejszenie stwierdzono dla ΔorfN, ΔPA14_23400 i ΔorfLM. Najniższą masę biofilmu odnotowano dla ΔPA14_23400 – 73,5% wartości szczepu typu dzikiego.

Inny obraz uzyskano przy analizie przestrzennej biofilmu za pomocą CLSM. Po 48 godzinach mutanty ΔorfLM, ΔorfN, ΔwbpM oraz mutant ligazy O-antygenu ΔPA14_66100 tworzyły odrębny klaster architektury biofilmu w porównaniu z PA14 typu dzikiego, Δwzz i ΔPA14_23400.

Mutanty z tej pierwszej grupy osiągały dużą biovolume już po 24 godzinach, podczas gdy PA14 typu dzikiego, Δwzz i ΔPA14_23400 osiągały podobne wartości dopiero po 48 godzinach. U części mutantów po 48 godzinach obserwowano już tendencję do zmniejszenia objętości biofilmu. Autorzy interpretują te wyniki jako szybszy początkowy rozwój i wcześniejszą konsolidację struktury biofilmu przy zaburzonej ekspresji OSA.

Oporność na antybiotyki ujawniała się tylko w części warunków

Jednym z najbardziej istotnych wyników pracy było wykazanie, że fenotyp wrażliwości na antybiotyki zależał od zastosowanej metody badania.

W oznaczeniach Etest wykonywanych na podłożu stałym mutanty ΔorfLM, ΔorfN i ΔwbpM wykazywały dwu- do czterokrotnie większe wartości MIC dla amikacyny, tobramycyny i ceftazydymu niż PA14 typu dzikiego. W przypadku ΔwbpM stwierdzono również około dwukrotnie wyższe MIC lewofloksacyny. Dla ΔPA14_23400 obserwowano mniejsze, około dwu- lub trzykrotne zwiększenie MIC części badanych antybiotyków.

Jednocześnie w klasycznej metodzie mikrorozcieńczeń w bulionie wartości MIC żadnego z mutantów nie różniły się od PA14 typu dzikiego dla żadnego z analizowanych antybiotyków.

Autorzy uznali zatem, że związany z OSA fenotyp oporności był warunkowy i ujawniał się podczas wzrostu związanego z powierzchnią, ale nie w płynnej hodowli używanej w teście mikrorozcieńczeń.

Amikacyna i ceftazydym w modelu Galleria mellonella

Zależność od OSA analizowano następnie w modelu zakażenia Galleria mellonella. Zakażenie PA14 typu dzikiego prowadziło do śmierci wszystkich larw w ciągu 28 godzin. W przypadku mutanta ΔwbpM przebieg był wolniejszy, a pełną śmiertelność obserwowano do 39 godzin. Z wyjątkiem Δwzz także pozostałe badane mutanty OSA wykazywały osłabioną zjadliwość w tym modelu.

W przypadku PA14 typu dzikiego zarówno amikacyna, jak i ceftazydym wydłużały przeżycie larw powyżej 46 godzin i prowadziły do eliminacji bakterii – odpowiednio w ciągu 6 i 4 godzin.

W zakażeniu mutantem ΔwbpM ceftazydym pozostawał aktywny, choć efekt był słabszy: po 48 godzinach przeżywało 30% larw, a pełną eliminację bakterii odnotowano po 18 godzinach. Amikacyna nie wpływała natomiast na przeżycie larw zakażonych ΔwbpM i nie eliminowała bakterii z organizmu gospodarza.

Autorzy wskazują, że wynik dotyczący amikacyny był zgodny z fenotypem obserwowanym w Etest, ale nie z oznaczeniem MIC metodą mikrorozcieńczeń w bulionie. Jest to jednak wynik uzyskany w przedklinicznym modelu Galleria mellonella, a nie w badaniu klinicznym u ludzi.

Mniejsza liczba bakterii wewnątrz makrofagów, ale większa cytotoksyczność części mutantów

W teście z makrofagami RAW264.7 wszystkie badane mutanty biosyntezy OSA poza Δwzz charakteryzowały się istotnie mniejszą liczbą bakterii wewnątrzkomórkowych po dwóch godzinach od zakażenia. Wartości wynosiły 30-63% poziomu obserwowanego dla PA14 typu dzikiego.

Jednocześnie mutanty ΔorfN i ΔwbpM prowadziły do istotnie większego uwalniania LDH po sześciu godzinach zakażenia, mimo wyraźnie mniejszej liczby bakterii wewnątrzkomórkowych. Wyniki wskazywały zatem na współistnienie ograniczonego pobierania bakterii przez makrofagi ze zwiększoną cytotoksycznością niektórych mutantów.

W abstrakcie i dyskusji autorzy wiążą tę obserwację także ze zwiększoną ekspresją genów systemu sekrecji typu III (T3SS).

Geny biosyntezy OSA były wyciszane w późniejszej fazie zakażenia modelowego

Autorzy zbadali następnie, czy ekspresja klastra biosyntezy antygenu O zmienia się podczas zakażenia. W tym celu po 20 godzinach infekcji larw Galleria mellonella szczepem PA14 przeprowadzono analizę transkryptomu bakterii uzyskanych z hemolimfy.

W późniejszym etapie zakażenia istotnie zwiększona była ekspresja m.in. genów systemu sekrecji typu III oraz genów związanych z produkcją pyowerdyny. Jednocześnie 10 genów klastra biosyntezy antygenu O – w tym orfKHEJLMN, PA14_23400, zbdP i hepP – wykazywało istotne obniżenie ekspresji in vivo, z log₂ fold change większym niż 1,5 i FDR <0,05.

Dla wzz i wbpM także obserwowano tendencję do spadku ekspresji, jednak różnice nie osiągnęły przyjętego progu istotności statystycznej.

OSA może pełnić różne funkcje na różnych etapach zakażenia

Autorzy proponują model, zgodnie z którym korzyść wynikająca z ekspresji OSA może zmieniać się wraz z etapem zakażenia. W początkowej fazie wyższa ekspresja OSA miałaby ułatwiać ruchliwość bakterii i chronić je przed elementami odporności wrodzonej, co sprzyjałoby ustanowieniu zakażenia.

Po rozwinięciu zakażenia ograniczenie ekspresji OSA mogłoby natomiast sprzyjać cechom związanym z utrzymywaniem się bakterii: zwiększonemu przywieraniu do powierzchni, zmianom rozwoju biofilmu, zmniejszonemu pobieraniu przez fagocyty, większej cytotoksyczności związanej z T3SS oraz oporności na antybiotyki ujawniającej się w określonych warunkach.

Jednocześnie brak OSA nie oznaczał po prostu „większej zjadliwości”. Mutanty z zaburzoną biosyntezą OSA były wyraźnie osłabione w modelu Galleria mellonella. Wyniki wspierają więc zależny od warunków i etapu zakażenia model, w którym obecność i ograniczenie ekspresji OSA mogą dawać bakterii odmienne korzyści biologiczne.

Znaczenie wyników

Praca pokazuje, że biologiczne skutki zmian zewnętrznej warstwy LPS P. aeruginosa wykraczają poza samą strukturę osłony komórkowej. Ekspresja OSA była powiązana z zachowaniem bakterii na powierzchniach, właściwościami biofilmu, oddziaływaniem z układem odpornościowym oraz wrażliwością na antybiotyki.

Szczególnie istotna jest obserwacja, że różnice w MIC ujawniały się w Etest wykonywanym na powierzchni stałej, ale znikały w metodzie mikrorozcieńczeń w płynnym podłożu. Autorzy wskazują, że standardowe testy lekowrażliwości mogą w określonych sytuacjach nie ujawniać fenotypów związanych ze wzrostem na powierzchni lub w biofilmie. Wyniki te pochodzą jednak z badań laboratoryjnych i modelu przedklinicznego.

Całość danych wspiera model, w którym ekspresja antygenu O nie ma jednej, niezmiennej funkcji podczas zakażenia. Korzyści biologiczne wynikające z obecności lub ograniczenia OSA zależą od środowiska, sposobu wzrostu bakterii i prawdopodobnie etapu procesu zakaźnego.