Po delecji genu aspB kaspofungina działała grzybobójczo na Aspergillus fumigatus

Badacze wykazali, że odpowiedź Aspergillus fumigatus na kaspofunginę zależy m.in. od cytoszkieletu septynowego. Usunięcie genu aspB sprawiło, że lek, który wobec tego grzyba ma zwykle działanie przede wszystkim grzybostatyczne, powodował utratę żywotności komórek grzyba. W neutropenicznym modelu mysim inwazyjnej aspergilozy zakażenie szczepem pozbawionym aspB i leczenie kaspofunginą wiązały się z lepszym przeżyciem oraz mniejszym obciążeniem grzybiczym. Wyniki mają jednak charakter przedkliniczny – nie badano u ludzi leku hamującego AspB.

Dlaczego odpowiedź Aspergillus fumigatus na kaspofunginę jest istotna?

Aspergillus fumigatus jest powszechnie występującym grzybem pleśniowym, którego zarodniki są obecne w środowisku i mogą być wdychane wraz z powietrzem. U osób ze sprawnie funkcjonującym układem odpornościowym kontakt z zarodnikami zazwyczaj nie prowadzi do inwazyjnego zakażenia. Sytuacja jest odmienna u pacjentów z ciężką immunosupresją, u których A. fumigatus może wywołać inwazyjną aspergilozę – chorobę obarczoną wysokim ryzykiem ciężkiego przebiegu i zgonu.

Jednym z istotnych ograniczeń leczenia zakażeń grzybiczych jest stosunkowo niewielka liczba klas leków przeciwgrzybiczych. Dodatkowym problemem jest narastająca oporność Aspergillus na część stosowanych terapii. Autorzy omawianej pracy skoncentrowali się na echinokandynach, a dokładniej na kaspofunginie.

Echinokandyny oddziałują na ścianę komórkową grzyba. W przypadku A. fumigatus kaspofungina wykazuje przede wszystkim aktywność grzybostatyczną – ogranicza wzrost i rozwój grzyba, ale nie prowadzi w typowych warunkach do jego skutecznego zabicia. Zespół badawczy postawił więc pytanie, jakie mechanizmy komórkowe pozwalają A. fumigatus przetrwać stres wywołany działaniem kaspofunginy.

Jak zaprojektowano badanie?

Pracę opublikowano w czasopiśmie Molecular Biology of the Cell. Pierwszą autorką jest Rebecca Jean Busch. Wśród współautorów znaleźli się Carson Doty, C. Allie Mills, Flutur Latifi, Laura E. Herring, Vjollca Konjufca, Francisco Carvallo, Tatiana Boluarte oraz José M. Vargas-Muñiz.

Badacze byli związani m.in. z Virginia Tech, Center for Emerging, Zoonotic, and Arthropod-borne Pathogens, Southern Illinois University-Carbondale, University of North Carolina at Chapel Hill, Virginia-Maryland College of Veterinary Medicine oraz Fralin Life Sciences Institute.

Centralnym elementem pracy były septyny – rodzina białek wiążących GTP, które uczestniczą w organizacji cytoszkieletu komórki. W A. fumigatus septyny mają znaczenie m.in. dla septacji, wytwarzania konidiów oraz odpowiedzi na zaburzenia integralności ściany komórkowej.

Wcześniejsze obserwacje wskazywały, że szczep pozbawiony genu aspB jest bardziej wrażliwy na związki oddziałujące na ścianę komórkową, zwłaszcza echinokandyny. W nowym badaniu zespół chciał dokładniej określić, czy zmiana podatności oznacza jedynie zahamowanie wzrostu, czy rzeczywistą utratę żywotności komórek grzyba oraz jakie mechanizmy molekularne mogą za to odpowiadać.

Co zmieniło usunięcie genów septynowych?

Badacze ocenili żywotność zmodyfikowanych genetycznie szczepów A. fumigatus po ekspozycji na kaspofunginę. Szczepy z delecjami genów aspA, aspB oraz aspC wykazywały istotnie mniejszą żywotność po kontakcie z lekiem. Równocześnie były bardziej podatne na kaspofunginę w badaniach prowadzonych na podłożach stałych.

Szczególnie istotny okazał się gen aspB. Jego delecja prowadziła do odpowiedzi, którą autorzy określili jako grzybobójczą. Innymi słowy, w tym zmodyfikowanym szczepie działanie kaspofunginy nie ograniczało się już tylko do zahamowania wzrostu grzyba – obserwowano utratę jego żywotności.

Wynik ten wskazuje, że cytoszkielet septynowy nie jest wyłącznie elementem strukturalnym komórki A. fumigatus. Może również uczestniczyć w mechanizmach adaptacyjnych pozwalających grzybowi przetrwać działanie leku zaburzającego funkcjonowanie ściany komórkowej.

Co wykazano w modelu inwazyjnej aspergilozy?

Po wynikach eksperymentów laboratoryjnych badacze przeszli do neutropenicznego modelu mysiego inwazyjnej aspergilozy. Taki model ma odzwierciedlać sytuację ciężkiego niedoboru odporności, w której ryzyko inwazyjnego zakażenia A. fumigatus jest szczególnie wysokie.

Zwierzęta zakażone szczepem ΔaspB, czyli pozbawionym genu aspB, i leczone kaspofunginą miały lepsze przeżycie niż zwierzęta zakażone szczepem typu dzikiego lub szczepem komplementowanym, w którym przywrócono funkcję genu. Analiza histologiczna wykazała również mniejsze obciążenie grzybicze w grupie zakażonej ΔaspB i otrzymującej kaspofunginę.

To ważne uzupełnienie wyników in vitro, ponieważ wskazuje, że efekt związany z brakiem AspB był widoczny również w żywym organizmie. Jednocześnie sposób zaprojektowania doświadczenia ma fundamentalne znaczenie dla interpretacji: myszy zakażano już genetycznie zmodyfikowanym szczepem grzyba.

Badanie nie polegało więc na zakażeniu typowym A. fumigatus, a następnie podaniu leku blokującego AspB. Takiego inhibitora w tym doświadczeniu nie oceniano. Wyniku nie można zatem interpretować jako dowodu, że istnieje obecnie terapia pozwalająca farmakologicznie odtworzyć efekt delecji aspB.

Proteomika wskazała elementy odpowiedzi na stres ściany komórkowej

Kolejnym etapem pracy była próba wyjaśnienia, w jaki sposób AspB może uczestniczyć w odpowiedzi A. fumigatus na kaspofunginę. Badacze wykorzystali oczyszczanie powinowactwa połączone z ilościową analizą proteomiczną, aby zidentyfikować białka związane z septynozależną odpowiedzią na lek.

Analiza wskazała kandydatów związanych z odpowiedzią na stres ściany komórkowej. Autorzy wytypowali cztery interaktory, których znaczenie następnie oceniano poprzez usuwanie odpowiadających im genów. Delecje tych genów powodowały większą podatność na kaspofunginę oraz umiarkowane zmniejszenie żywotności po ekspozycji na lek.

Wyniki wzmacniają hipotezę, że AspB działa jako element szerszej sieci odpowiedzialnej za adaptację komórki grzyba do uszkodzenia ściany komórkowej. Nie chodzi więc wyłącznie o pojedyncze białko, ale prawdopodobnie o zależności pomiędzy cytoszkieletem septynowym, organizacją ściany komórkowej i odpowiedzią na stres wywołany echinokandynami.

Autorzy podsumowują, że septyna AspB uczestniczy w odpowiedzi odpowiedzialnej za grzybostatyczny charakter działania kaspofunginy wobec A. fumigatus.

Co wyniki mogą oznaczać dla przyszłego leczenia?

Najbardziej interesującym kierunkiem wynikającym z pracy jest możliwość poszukiwania metod farmakologicznego zaburzania odpowiedzi septynowej A. fumigatus. Gdyby udało się bezpiecznie i selektywnie zahamować element mechanizmu zależnego od AspB, teoretycznie możliwe byłoby zwiększenie podatności grzyba na kaspofunginę lub inne echinokandyny.

Na obecnym etapie jest to jednak hipoteza wymagająca kolejnych badań. Eksperyment wykazał efekt delecji genu, a nie skuteczność związku chemicznego hamującego AspB. Genetyczne usunięcie białka od początku funkcjonowania komórki może również wywoływać konsekwencje inne niż czasowe zahamowanie jego aktywności przez potencjalny lek.

Przed ewentualnym przejściem do badań klinicznych konieczne byłoby m.in. opracowanie cząsteczek oddziałujących na odpowiedni cel, określenie ich selektywności wobec komórek grzyba, ocena toksyczności, farmakokinetyki i farmakodynamiki oraz potwierdzenie skuteczności wobec reprezentatywnych klinicznych izolatów A. fumigatus.

Dlaczego wynik jest interesujący mimo przedklinicznego charakteru?

W badaniach nad lekami przeciwgrzybiczymi szczególnie istotne jest identyfikowanie mechanizmów, które pozwalają patogenowi przeżyć ekspozycję na terapię. W tym przypadku autorzy nie zaproponowali jedynie kolejnej substancji przeciwgrzybiczej, lecz wskazali biologiczny mechanizm potencjalnie odpowiadający za ograniczenie skuteczności istniejącej klasy leków.

Jeżeli dalsze badania potwierdzą, że septyny lub ich kluczowe interakcje można selektywnie blokować farmakologicznie, możliwa stałaby się strategia polegająca na osłabieniu mechanizmów obronnych grzyba i jednoczesnym wykorzystaniu działania echinokandyny. Jest to jednak perspektywa badawcza, a nie gotowa metoda terapeutyczna.

Praca Rebecca Jean Busch i współautorów dostarcza zatem przede wszystkim mechanistycznego uzasadnienia dla dalszych badań nad septynami A. fumigatus jako potencjalnymi celami terapeutycznymi. Szczególnie istotne będzie ustalenie, czy efekt obserwowany po całkowitej delecji aspB można odtworzyć za pomocą interwencji farmakologicznej bez utraty selektywności i bezpieczeństwa.