Naukowcy zidentyfikowali trzy geny kluczowe dla tworzenia biofilmu przez Salmonella Typhimurium

Trzy geny bakterii Salmonella enterica serowar Typhimurium, oznaczone jako lon, csgF i rfbF, odgrywają istotną rolę w tworzeniu biofilmu, adhezji do powierzchni oraz wirulencji patogenu. W badaniu opublikowanym 4 listopada 2026 roku na łamach The FEBS Journal naukowcy wykazali, że zaburzenie funkcji tych genów ogranicza zdolność bakterii do organizowania przestrzennej struktury biofilmu, a w modelu mysim wiąże się również ze zmniejszeniem kolonizacji narządów i osłabieniem zjadliwości. Wyniki wskazują potencjalne cele molekularne przyszłych strategii przeciwdziałania zakażeniom wywoływanym przez wielolekooporne szczepy Salmonella Typhimurium.

Znaczenie biofilmu w zakażeniach Salmonella Typhimurium

Salmonella enterica serowar Typhimurium jest jednym z istotnych patogenów bakteryjnych przenoszonych drogą pokarmową. Zakażenia wywoływane przez ten drobnoustrój mogą prowadzić do zapalenia żołądka i jelit, natomiast u osób z zaburzeniami odporności istnieje również ryzyko ciężkiego, inwazyjnego przebiegu choroby.

Jednym z mechanizmów sprzyjających przetrwaniu bakterii jest zdolność do tworzenia biofilmu, czyli zorganizowanej, wielokomórkowej struktury bakteryjnej związanej z powierzchnią i otoczonej wytwarzaną przez drobnoustroje macierzą zewnątrzkomórkową.

Obecność biofilmu może zwiększać tolerancję bakterii na niekorzystne warunki środowiskowe, działanie środków przeciwdrobnoustrojowych oraz mechanizmy obronne gospodarza. Zjawisko to ma znaczenie nie tylko w przebiegu zakażeń, ale również w utrzymywaniu się drobnoustrojów na powierzchniach kontaktujących się z żywnością i w środowisku produkcyjnym.

W przypadku Salmonella Typhimurium szczególnie istotne pozostaje poznanie mechanizmów genetycznych regulujących przechodzenie bakterii od swobodnego wzrostu w zawiesinie do tworzenia zorganizowanych struktur związanych z powierzchnią.

Właśnie temu zagadnieniu poświęcono badanie zatytułowane „Transposon mutagenesis identifies lon, csgF, and rfbF as critical genetic determinants of biofilm architecture and adhesion in multidrug-resistant Salmonella Typhimurium”.

Autorami publikacji są Qianwen Ge, Ting Ye, Shuai Ma i Lingyan Jiang. Wśród jednostek badawczych związanych z autorami znajduje się National Key Laboratory of Intelligent Tracking and Forecasting for Infectious Diseases oraz TEDA Institute of Biological Sciences and Biotechnology, Nankai University w Tianjin w Chinach.

Badacze skoncentrowali się na identyfikacji genów, których funkcjonowanie jest szczególnie ważne dla tworzenia biofilmu przez wielolekooporny szczep S. Typhimurium, oraz na ustaleniu, czy zaburzenie tych genów wpływa również na adhezję do komórek gospodarza i wirulencję bakterii.

Metodologia badania i charakterystyka izolatów

Badanie miało charakter eksperymentalny i obejmowało kilka wzajemnie uzupełniających się etapów: ocenę fenotypową izolatów bakteryjnych, mutagenezę transpozonową, analizę genomową, badania mikroskopowe, testy adhezji, analizę transkryptomiczną oraz doświadczenia na modelu zwierzęcym.

Ocena 708 izolatów Salmonella Typhimurium

W pierwszym etapie naukowcy ocenili zdolność tworzenia biofilmu przez 708 izolatów S. Typhimurium. Pozwoliło to określić zróżnicowanie analizowanego materiału pod względem tego fenotypu i wyodrębnić izolaty szczególnie intensywnie wytwarzające biofilm.

Następnie do dalszych doświadczeń wybrano kliniczny izolat oznaczony jako 15E341, charakteryzujący się silną zdolnością tworzenia biofilmu.

Mutageneza transpozonowa i identyfikacja genów

Do poszukiwania genetycznych determinant tworzenia biofilmu wykorzystano mutagenezę transpozonową z zastosowaniem systemu EZ-Tn5.

Metoda ta umożliwia zaburzanie funkcji genów bakteryjnych poprzez wprowadzanie do genomu elementów transpozonowych. Następnie można porównywać właściwości uzyskanych mutantów ze szczepem wyjściowym i identyfikować zmiany związane z określonym fenotypem.

W badaniu wygenerowano około 5000 mutantów izolatu 15E341. Po przeprowadzeniu przesiewowej oceny fenotypowej oraz sekwencjonowania całogenomowego zidentyfikowano trzy loci genetyczne, których zaburzenie prowadziło do wyraźnego ograniczenia zdolności tworzenia biofilmu.

Były to geny lon, csgF i rfbF.

Wielopoziomowa ocena skutków mutacji

Badacze nie ograniczyli się do pomiaru ilości wytwarzanego biofilmu. Wykorzystali również laserową mikroskopię konfokalną (LSCM) i skaningową mikroskopię elektronową z emisją polową (FESEM), aby ocenić jego strukturę przestrzenną.

Dodatkowo przeprowadzono eksperymenty dotyczące przylegania bakterii do komórek nabłonkowych Caco-2 oraz do powierzchni niebiologicznych, w tym szkła i silikonu.

Analiza transkryptomiczna pozwoliła natomiast scharakteryzować zmiany ekspresji genów związanych między innymi z aparatem ruchu i strukturami adhezyjnymi bakterii.

Ostatni etap obejmował ocenę wirulencji mutantów w modelu mysim, ze szczególnym uwzględnieniem przeżycia zakażonych zwierząt oraz kolonizacji wybranych narządów.

Zdolność tworzenia biofilmu i identyfikacja genów

Większość analizowanych izolatów tworzyła biofilm

Wyniki przesiewowej oceny 708 izolatów wykazały, że zdolność do tworzenia biofilmu była częstą właściwością badanych bakterii.

Biofilm tworzyło 88,56% analizowanych izolatów. Jednocześnie 3,81% badanych zaklasyfikowano jako silnych producentów biofilmu. Autorzy odnotowali związek tego fenotypu z nasilonym występowaniem wielolekooporności.

Wyniki te wskazują na znaczne zróżnicowanie fenotypowe w obrębie badanej grupy izolatów. Sama zdolność tworzenia biofilmu była rozpowszechniona, jednak szczególnie intensywne jego wytwarzanie stwierdzono u stosunkowo niewielkiej części bakterii.

Obserwowana współzależność między silnym tworzeniem biofilmu a wielolekoopornością jest istotna z mikrobiologicznego punktu widzenia. Nie oznacza jednak, że biofilm sam w sobie stanowi mechanizm genetycznej oporności na antybiotyki ani że jego wytwarzanie było przyczyną wielolekooporności badanych izolatów.

Należy również podkreślić, że odsetki te odnoszą się do zbioru 708 izolatów uwzględnionych w publikacji. Nie są oszacowaniem częstości występowania poszczególnych fenotypów w całej populacji S. Typhimurium.

Zaburzenie trzech genów istotnie ograniczało powstawanie biofilmu

Najważniejszym wynikiem analizy mutantów było ustalenie, że zaburzenie genów lon, csgF lub rfbF prowadziło do istotnego ograniczenia tworzenia biofilmu.

Jednocześnie autorzy nie stwierdzili wpływu tych mutacji na wzrost bakterii w formie planktonicznej, czyli jako komórek pozostających w zawiesinie, niezorganizowanych w biofilm.

Rozróżnienie to ma podstawowe znaczenie dla interpretacji wyników. Obserwowany efekt nie sprowadzał się do ogólnego zahamowania namnażania bakterii, lecz dotyczył szczególnie ich zdolności do organizowania się w wielokomórkowe struktury związane z powierzchnią.

Badania mikroskopowe wykazały ponadto wyraźne zaburzenia trójwymiarowej architektury biofilmu oraz ograniczenie kolonizacji powierzchni przez mutanty.

Funkcje genów lon, csgF i rfbF

Trzy zidentyfikowane geny pełnią odmienne funkcje biologiczne. Ich znaczenie dla tworzenia biofilmu wskazuje, że proces ten zależy od współdziałania wielu elementów komórki bakteryjnej, a nie od pojedynczego mechanizmu molekularnego.

Gen lon – regulacja odpowiedzi na stres i wirulencji

Gen lon koduje proteazę Lon, białko uczestniczące w regulacji procesów komórkowych, odpowiedzi na stres oraz wirulencji bakterii.

Rola Lon jako regulatora odpowiedzi stresowej i czynników zjadliwości była znana wcześniej. Nowe badanie dostarcza natomiast dodatkowych danych wskazujących, że prawidłowe funkcjonowanie tego układu jest również ważne dla organizacji biofilmu w analizowanym szczepie S. Typhimurium.

Zaburzenie genu lon powodowało ograniczenie zdolności tworzenia biofilmu, co wskazuje na jego udział w koordynowaniu procesów niezbędnych do powstania stabilnej struktury bakteryjnej.

Gen csgF – organizacja włókien curli

Gen csgF jest związany z powstawaniem włókien curli, czyli bakteryjnych struktur amyloidowych uczestniczących w adhezji oraz organizacji biofilmu.

Białko CsgF jest znanym elementem układu odpowiedzialnego za prawidłowe formowanie tych włókien.

Uzyskane wyniki są zgodne ze znaczeniem struktur powierzchniowych dla stabilności biofilmu. Zaburzenie funkcji csgF prowadziło do osłabienia tworzenia biofilmu i pogorszenia zdolności przylegania bakterii do badanych powierzchni.

Wynik ten wskazuje, że integralność struktur adhezyjnych stanowi ważny składnik zdolności S. Typhimurium do kolonizacji powierzchni.

Gen rfbF – udział biosyntezy antygenu O w powstawaniu biofilmu

Szczególnie interesującym elementem publikacji jest identyfikacja znaczenia genu rfbF.

Gen ten koduje enzym uczestniczący w biosyntezie antygenu O, stanowiącego składnik lipopolisacharydu (LPS) bakterii Gram-ujemnych.

W przeciwieństwie do wcześniej poznanych funkcji białek Lon i CsgF znaczenie RfbF dla zdolności tworzenia biofilmu przez S. Typhimurium było dotychczas słabiej scharakteryzowane.

W omawianym badaniu zaburzenie rfbF wyraźnie ograniczało tworzenie biofilmu, wskazując na powiązanie procesów odpowiedzialnych za budowę struktur powierzchniowych bakterii z organizacją ich wielokomórkowych skupisk.

Autorzy uznają RfbF za istotną determinantę tego fenotypu, wymagającą dalszych badań mechanistycznych.

Wpływ mutacji na adhezję, ekspresję genów i wirulencję

Ograniczenie przylegania do komórek nabłonkowych i powierzchni niebiologicznych

Kolejnym etapem badań była ocena adhezji mutantów do komórek oraz materiałów niebiologicznych.

Do doświadczeń z wykorzystaniem powierzchni biologicznej zastosowano komórki Caco-2, będące linią komórkową wykorzystywaną w badaniach nad nabłonkiem jelitowym.

W porównaniu z właściwościami szczepu wyjściowego mutanty z zaburzonymi genami lon, csgF i rfbF wykazywały istotnie zmniejszoną zdolność adhezji do komórek Caco-2.

Analogiczny kierunek zmian zaobserwowano w doświadczeniach wykorzystujących powierzchnie szkła i silikonu.

Wyniki te wskazują, że identyfikowane determinanty genetyczne mają znaczenie nie tylko dla końcowej architektury biofilmu, ale również dla właściwości adhezyjnych bakterii.

Ma to potencjalne znaczenie w kontekście zarówno interakcji bakterii z gospodarzem, jak i utrzymywania się drobnoustrojów na powierzchniach niebiologicznych.

Zmiany transkryptomiczne: wzrost ekspresji genów wici i ograniczenie ekspresji genów fimbrii

Analiza transkryptomiczna ujawniła zmiany w funkcjonowaniu układów genetycznych uczestniczących w organizacji struktur powierzchniowych bakterii.

Autorzy zaobserwowali wyraźne zwiększenie ekspresji szlaków związanych z powstawaniem wici bakteryjnych oraz zmniejszenie ekspresji genów związanych z fimbriami.

Wici uczestniczą przede wszystkim w ruchliwości bakterii, natomiast fimbrie stanowią struktury powierzchniowe ważne dla adhezji.

Zaobserwowany profil ekspresji wskazuje na zmianę regulacji procesów związanych z ruchliwością i przyleganiem bakterii. Może on pomagać wyjaśnić, dlaczego zaburzenie określonych genów powoduje tak wyraźne zmiany organizacji biofilmu.

Sama analiza transkryptomiczna nie rozstrzyga jednak, które ze zmian ekspresji stanowią bezpośrednie przyczyny obserwowanego fenotypu, a które są wtórną odpowiedzią komórki na zaburzenie funkcji badanych genów.

Zmniejszona wirulencja w modelu mysim

Jednym z najważniejszych elementów pracy było rozszerzenie doświadczeń laboratoryjnych o badanie właściwości mutantów w modelu zwierzęcym.

W doświadczeniach na myszach bakterie z zaburzonymi genami lon, csgF lub rfbF wykazywały osłabioną wirulencję.

Efekt ten stwierdzono na podstawie zwiększonego przeżycia zakażonych zwierząt oraz istotnie ograniczonej kolonizacji wybranych narządów.

Zmniejszone obciążenie bakteryjne zaobserwowano w:

• jelicie ślepym,
• wątrobie,
• śledzionie.

Wyniki wskazują, że konsekwencje zaburzenia badanych genów nie ograniczają się do zmian fenotypu obserwowanych w warunkach laboratoryjnych. Towarzyszy im również zmniejszenie zdolności bakterii do wywoływania ciężkiego zakażenia w zastosowanym modelu zwierzęcym.

Nie można jednak na tej podstawie przyjąć, że całe osłabienie wirulencji wynika wyłącznie z ograniczenia tworzenia biofilmu. Badane geny mogą uczestniczyć także w innych procesach istotnych dla zakażenia.

Możliwe zastosowania i ograniczenia interpretacji

Czy zidentyfikowane geny mogą stać się celami nowych terapii?

Uzyskane wyniki wskazują na możliwość dalszego badania szlaków zależnych od Lon, CsgF i RfbF jako potencjalnych celów interwencji ukierunkowanych na biofilm bakteryjny.

Istotą takiego podejścia byłoby ograniczanie procesów niezbędnych do organizacji biofilmu, przylegania bakterii do powierzchni i utrzymywania się zakażenia.

W kontekście wielolekoopornych szczepów Salmonella szczególnie interesująca jest obserwacja, że zaburzenie trzech genów wpływało na powstawanie biofilmu bez wyraźnego zahamowania wzrostu bakterii w postaci planktonicznej.

Oznacza to, że zidentyfikowano zależności biologiczne odmienne od prostego hamowania namnażania drobnoustrojów.

Nie oznacza natomiast, że wykazano skuteczność jakiegokolwiek nowego leku przeciwbakteryjnego. Badanie polegało na eksperymentalnym zaburzaniu funkcji genów, a nie na ocenie działania gotowych inhibitorów tych białek u pacjentów.

Ewentualne opracowanie interwencji farmakologicznej wymagałoby kolejnych etapów obejmujących identyfikację odpowiednich substancji, wykazanie ich aktywności, ocenę selektywności działania oraz bezpieczeństwa i skuteczności w dalszych badaniach przedklinicznych i klinicznych.

Potencjalne znaczenie dla bezpieczeństwa żywności

Autorzy publikacji wskazują również na potrzebę badania zidentyfikowanych szlaków w kontekście ograniczania biofilmu w produkcji żywności i rolnictwie.

Takie zainteresowanie jest uzasadnione zdolnością Salmonella Typhimurium do przylegania do powierzchni niebiologicznych oraz tworzenia struktur sprzyjających przetrwaniu bakterii.

Doświadczenia z wykorzystaniem szkła i silikonu dostarczyły danych wskazujących, że zaburzenie badanych genów może osłabiać właściwości adhezyjne bakterii również poza środowiskiem komórek gospodarza.

Wyniki te nie stanowią jednak potwierdzenia skuteczności konkretnej procedury dekontaminacji w warunkach przemysłowych. Takie zastosowanie wymagałoby odrębnej weryfikacji w odpowiednich warunkach środowiskowych i technologicznych.

Ograniczenia i dalsze kierunki badań

Przedstawione wyniki mają charakter przedkliniczny i dotyczą mechanizmów biologicznych bakterii. Szczególnie ważne jest odróżnienie identyfikacji potencjalnego celu molekularnego od opracowania skutecznej metody zapobiegania zakażeniom lub ich leczenia.

Eksperymenty prowadzone na mutantach pojedynczego, silnie tworzącego biofilm izolatu klinicznego nie pozwalają również automatycznie przenieść wszystkich obserwacji na pozostałe szczepy i serowary Salmonella.

Dalsze badania powinny wyjaśnić, w jakim stopniu zależności zaobserwowane w izolacie 15E341 są zachowane w innych szczepach oraz czy szlaki związane z trzema genami można skutecznie i selektywnie modulować przy użyciu odpowiednich interwencji.

Wnioski autorów

Wyniki opublikowane w The FEBS Journal wskazują, że powstawanie biofilmu u Salmonella Typhimurium jest procesem wymagającym współdziałania odmiennych mechanizmów molekularnych.

Geny lon, csgF i rfbF okazały się istotnymi determinantami struktury biofilmu i adhezji w badanym modelu. Ich zaburzenie wiązało się również ze zmniejszeniem wirulencji bakterii w doświadczeniach na zwierzętach.

Wartość naukowa pracy polega przede wszystkim na połączeniu analizy genetycznej z charakterystyką fenotypową, transkryptomiczną i wynikami badań przedklinicznych.

Najważniejszą perspektywą wynikającą z tych ustaleń jest możliwość dalszego poszukiwania strategii ograniczających tworzenie biofilmu i zdolność kolonizacji przez Salmonella Typhimurium. Na obecnym etapie są to jednak potencjalne kierunki badań, a nie metody profilaktyki lub leczenia o potwierdzonej skuteczności klinicznej.