CANDI: platforma CRISPR do identyfikacji prątków w 3,5 godziny

Platforma CANDI, łącząca technologię CRISPR-Cas12a z fluorescencyjnie kodowanymi nanokroplami, umożliwiła w badaniu identyfikację klinicznie istotnych prątków do poziomu podgatunku w ciągu 3,5 godziny. W analizie 230 próbek klinicznych autorzy uzyskali czułość 97,08% i swoistość 99,7% względem identyfikacji opartej na hodowli. Wyniki opublikowano w Science Translational Medicine.

Dlaczego identyfikacja prątków jest problemem diagnostycznym?

Prątki niegruźlicze (NTM; ang. nontuberculous mycobacteria) stanowią zróżnicowaną grupę drobnoustrojów z rodzaju Mycobacterium. Autorzy publikacji zwracają uwagę, że częstość zakażeń NTM i związana z nimi śmiertelność zwiększają się wraz ze starzeniem populacji, a w części regionów zakażenia te występują już częściej niż infekcje powodowane przez prątki należące do kompleksu Mycobacterium tuberculosis.

Problem kliniczny nie ogranicza się jednak do samego wykrycia obecności prątków. Poszczególne gatunki i podgatunki wykazują istotne zróżnicowanie biologiczne, dlatego identyfikacja na możliwie dokładnym poziomie może mieć znaczenie dla dalszego postępowania diagnostycznego i terapeutycznego. Jednocześnie klasyczna identyfikacja wykorzystująca hodowlę jest czasochłonna. W komunikacie Tulane University wskazano, że cały proces może wymagać od około czterech do sześciu tygodni.

Komunikat prasowy zwraca również uwagę na kliniczne podobieństwo choroby płuc wywoływanej przez NTM i gruźlicy. Może ono komplikować proces diagnostyczny, podczas gdy schematy postępowania w obu sytuacjach nie są tożsame. Z perspektywy pulmonologii i mikrobiologii klinicznej istotne jest zatem nie tylko szybkie stwierdzenie obecności prątków, ale także możliwie precyzyjne określenie czynnika etiologicznego.

Jak działa platforma CANDI?

Badacze opracowali platformę określoną jako CANDI – CRISPR-assisted Nanodroplet Differential Identification. Metoda łączy amplifikację materiału docelowego niezależną od badanego gatunku z gatunkowo swoistą detekcją wykorzystującą białko CRISPR-associated protein 12a (Cas12a).

Kluczowym elementem systemu są fluorescencyjnie kodowane nanokrople. Poszczególne reakcje CRISPR są w nich przestrzennie rozdzielane, co pozwala jednocześnie analizować wiele celów w ramach pojedynczego oznaczenia. Rozwiązanie ma przeciwdziałać jednemu z ograniczeń klasycznych testów wykorzystujących CRISPR – trudności w prowadzeniu wielokierunkowej, równoczesnej identyfikacji wielu blisko spokrewnionych drobnoustrojów.

W pracy przedstawiono panel 16-plex, zaprojektowany do rozróżniania 15 klinicznie istotnych gatunków i podgatunków z rodzaju Mycobacterium. Dostępny abstrakt nie przedstawia pełnej listy wszystkich elementów panelu, dlatego nie należy jej odtwarzać na podstawie domysłów lub danych pochodzących z innych etapów rozwoju technologii.

Autorzy informują również, że CANDI osiągała wysoką czułość analityczną i umożliwiała prawidłowe rozróżnianie prątków w próbkach zawierających więcej niż jeden gatunek lub podgatunek. Jest to ważny aspekt koncepcji technologicznej – platforma została zaprojektowana nie tylko jako test binarny wykrywający obecność prątków, ale jako narzędzie do wielokierunkowej identyfikacji.

Jak oceniano metodę w materiale klinicznym?

Walidację kliniczną opisaną w abstrakcie przeprowadzono z wykorzystaniem 230 próbek. Materiał obejmował plwocinę, aspiraty tchawicze oraz inne płyny pochodzące z dróg oddechowych.

Punktem odniesienia dla parametrów diagnostycznych przedstawionych w abstrakcie była identyfikacja oparta na hodowli. Autorzy oceniali możliwość określenia gatunku i podgatunku prątka, a nie wyłącznie wykrycie materiału należącego do rodzaju Mycobacterium.

Publikacja ma charakter badania diagnostycznego wykorzystującego materiał pochodzący od ludzi, a nie badania klinicznego interwencyjnego. Nie oceniano w nim skuteczności leczenia ani wpływu zastosowania CANDI na rokowanie pacjentów.

Czułość, swoistość i czas uzyskania wyniku

W 230 analizowanych próbkach klinicznych platforma umożliwiała uzyskanie identyfikacji do poziomu podgatunku w ciągu 3,5 godziny. W odniesieniu do identyfikacji opartej na hodowli czułość wyniosła 97,08%, a swoistość 99,7%.

Warto zwrócić uwagę na różnicę pomiędzy sposobem przedstawienia wyników w komunikacie prasowym a danymi zawartymi w abstrakcie publikacji. Materiał Tulane University upraszcza wynik do około 97,3% trafności identyfikacji gatunków i podgatunków. Publikacja naukowa podaje natomiast dwa odrębne parametry diagnostyczne: czułość 97,08% oraz swoistość 99,7%. W materiale przeznaczonym dla profesjonalistów medycznych bardziej właściwe jest posługiwanie się wartościami przedstawionymi bezpośrednio w abstrakcie pracy.

Co wyniki mogą oznaczać dla praktyki klinicznej?

Z perspektywy diagnostyki mykobakterioz zasadniczym wynikiem jest połączenie krótkiego czasu oznaczenia z możliwością różnicowania wielu gatunków i podgatunków. Autorzy wskazują, że technologia ma potencjał ograniczenia zależności diagnostyki od długotrwałej hodowli i stworzenia szybszego modelu identyfikacji w obrębie złożonego genetycznie rodzaju Mycobacterium.

W praktyce klinicznej potencjalne znaczenie takiego rozwiązania wiązałoby się przede wszystkim ze skróceniem czasu pomiędzy pobraniem materiału a uzyskaniem informacji mikrobiologicznej na poziomie istotnym dla dalszej diagnostyki. Ma to szczególne znaczenie w sytuacji, w której samo stwierdzenie obecności prątków nie rozstrzyga jeszcze o etiologii choroby.

Jednocześnie wyniku badania nie należy interpretować jako dowodu, że CANDI może obecnie zastąpić cały standardowy proces diagnostyki mykobakteriologicznej. Abstrakt przedstawia wyniki identyfikacji gatunkowej i podgatunkowej, ale nie opisuje wdrożenia metody jako samodzielnego zamiennika wszystkich badań wykonywanych w laboratorium mikrobiologicznym.

W szczególności z dostępnych danych nie wynika, aby przedmiotem publikacji było zastąpienie badań lekowrażliwości. Identyfikacja mikroorganizmu i określenie jego wrażliwości na leki są odrębnymi etapami diagnostyki, dlatego bardzo szybka identyfikacja gatunku nie powinna być utożsamiana z pełną charakterystyką mikrobiologiczną potrzebną do zaplanowania leczenia.

Technologia może mieć szersze zastosowanie

Autorzy traktują CANDI jako platformę technologiczną. Połączenie wielokierunkowego rozpoznawania molekularnego z fluorescencyjnie kodowanymi nanokroplami może potencjalnie zostać przystosowane do wykrywania innych drobnoustrojów, jednak obecna publikacja dotyczy identyfikacji prątków. Ewentualnej skuteczności w innych zakażeniach nie można wyprowadzać z wyników przedstawionych dla tego panelu.

Międzynarodowy zespół badawczy

Wśród autorów publikacji znaleźli się m.in. Hongquan Gou, Long Chen, Kelly L. Eick, Duran Bao, Taryn A. Miner, Bo Ning i Tony Hu. W badania zaangażowano naukowców z kilku ośrodków, w tym Tulane University School of Medicine, Shanghai Tenth People’s Hospital, Tongji University, University of North Carolina at Chapel Hill, NIH Clinical Center, Shanghai Pulmonary Hospital oraz Tsinghua University.

Bo Ning, związany z Tulane University School of Medicine, został w komunikacie prasowym Tulane University wskazany jako jeden z głównych badaczy projektu. Autorzy pracy podkreślają, że docelową wartością platformy ma być połączenie wysokiej swoistości detekcji CRISPR z możliwością skalowalnej analizy wielu celów jednocześnie.

Jakich wniosków nie można jeszcze wyciągnąć?

Najważniejszą wartością publikacji jest zatem demonstracja możliwości szybkiej, wielokierunkowej identyfikacji prątków w materiale klinicznym z bardzo wysoką swoistością względem identyfikacji hodowlanej. Dalsza ocena przydatności technologii w rutynowej praktyce będzie wymagała danych wykraczających poza informacje dostępne w abstrakcie.