CRISPR i dSHERLOCK w precyzyjnej diagnostyce zakażeń supergrzyba Candida auris

Zakażenie patogennym drożdżakiem Candida auris (C. auris) może mieć dramatyczne konsekwencje zdrowotne dla pacjentów hospitalizowanych oraz mieszkańców domów opieki długoterminowej, zwłaszcza osób już osłabionych innymi chorobami. Patogen ten łatwo się rozprzestrzenia, kolonizuje powierzchnie i przedmioty, na których może przetrwać od kilku tygodni do nawet kilku miesięcy, a ponadto często wykazuje oporność na standardowo stosowane środki dezynfekcyjne. Zakażenia C. auris są szczególnie groźne u pacjentów po przeszczepach narządów, leczonych chemioterapią oraz u osób z upośledzoną odpornością, na przykład zakażonych HIV. Stanowią również istotne zagrożenie dla pacjentów obciążonych wysokim ryzykiem infekcji, takich jak osoby wymagające stosowania inwazyjnych wyrobów medycznych, w tym rurek intubacyjnych, zgłębników do karmienia czy różnego rodzaju cewników. Po zajęciu krwiobiegu lub narządów krytycznych zakażenia C. auris stają się stanem bezpośredniego zagrożenia życia, z objawami i reakcjami immunologicznymi przypominającymi te obserwowane w ciężkich zakażeniach bakteryjnych i wirusowych.

Choć zakażenia C. auris mogą być teoretycznie leczone kilkoma lekami przeciwgrzybiczymi, w krótkim czasie pojawiły się szczepy wykazujące oporność przeciwdrobnoustrojową (AMR) na dostępne terapie. Zjawisko to stało się poważnym wyzwaniem klinicznym dla lekarzy szpitalnych. W praktyce oznacza to konieczność zmiany pierwotnie dobranego leku przeciwgrzybiczego lub – w najgorszym scenariuszu – całkowity brak skutecznych opcji terapeutycznych. W takich przypadkach dalsze podawanie nieskutecznych leków wiąże się wyłącznie z dodatkowym, nieuzasadnionym obciążeniem organizmu pacjenta.

„Klinicyści potrzebują znacznie skuteczniejszego podejścia diagnostycznego, które pozwoli precyzyjnie określić ilość patogenu u pacjentów oraz ocenić jego oporność na leki przeciwgrzybicze, aby lepiej reagować na zakażenia C. auris i zapobiegać przyszłym ogniskom szpitalnym” – podkreśla Justin Rolando, PhD, pierwszy autor nowego badania. Jak zaznacza, obecnie stosowane metody diagnostyczne są kosztowne, czasochłonne oraz wymagają skomplikowanej aparatury i wysoko wyspecjalizowanego personelu, co znacząco ogranicza ich praktyczną użyteczność.

Nowe badanie przedstawia rozwiązanie tego problemu w postaci precyzyjnej metody diagnostycznej nowej generacji, która po raz pierwszy umożliwia szybkie i dokładne ilościowe oznaczanie szczepów C. auris z łatwo dostępnych wymazów, a także identyfikację mutacji odpowiedzialnych za oporność przeciwdrobnoustrojową w populacjach grzybów o zróżnicowanej wrażliwości na leki. Opracowany test bazuje na wcześniejszych osiągnięciach zespołów kierowanych przez Davida Walta, PhD, oraz Jamesa Collinsa, PhD, i powstał we współpracy z Wadsworth Center Mycology Lab przy New York State Department of Health, które dostarczyło pierwszą kohortę próbek pacjentów do walidacji technologii.

Zespół badawczy połączył technologię SHERLOCK – opartą na CRISPR metodę diagnostyczną opracowaną w grupie Collinsa, umożliwiającą wykrywanie sekwencji kwasów nukleinowych z precyzją pojedynczego nukleotydu – z ultrasensytywną technologią mikroarray pojedynczych cząsteczek rozwijaną w grupie Walta. Monitorując w czasie rzeczywistym rozwój subtelnych sygnałów fluorescencyjnych generowanych przez tysiące równoległych testów pojedynczych cząsteczek oraz analizując je z wykorzystaniem metod sztucznej inteligencji opartych na uczeniu maszynowym, naukowcy opracowali szybkie i ilościowe podejście nazwane dSHERLOCK (digital SHERLOCK). Metoda ta umożliwia ocenę stopnia kolonizacji C. auris w próbkach pacjentów oraz precyzyjne wskazanie mutacji odpowiadających za konkretne mechanizmy oporności przeciwdrobnoustrojowej. Wyniki badań opublikowano w czasopiśmie Nature Biomedical Engineering.

Nowe zastosowanie technologii SHERLOCK

W 2019 roku, po serii ognisk zakażeń C. auris wywołanych przez szczepy oporne na leczenie, New York State Department of Health wystosował pilne wezwanie do przyspieszenia rozwoju nowych metod diagnostycznych. James Collins wraz ze współautorami Heleną de Puig, PhD, oraz Xiao Tanem, MD, PhD, zaproponowali wykorzystanie systemu SHERLOCK do tego celu. Projekt uzyskał finansowanie, a do zespołu dołączyła Nicole Weckman, PhD, która skoncentrowała się na projektowaniu testów CRISPR do wykrywania C. auris i współtworzeniu narzędzia o realnej wartości klinicznej.

Zastosowanie dSHERLOCK umożliwiło wiarygodne wykrywanie C. auris w wymazach dostarczonych przez Wadsworth Center. Cały test trwa około 20 minut, a precyzyjna ilościowa analiza obciążenia patogenem możliwa jest w ciągu 40 minut. Dla porównania, standardowa diagnostyka kliniczna wymaga przesyłania próbek do jednego z kilku wyspecjalizowanych laboratoriów referencyjnych, a czas oczekiwania na wynik może sięgać nawet tygodnia, podczas gdy pacjenci wymagają natychmiastowego leczenia.

Kluczowym osiągnięciem było również wykazanie, że dzięki modyfikacji mechanizmu detekcji CRISPR możliwe jest różnicowanie mutacji związanych z opornością na najczęściej stosowane leki przeciwgrzybicze z grup azoli i echinokandyn. Charakterystyczne „kinetyki” sygnałów fluorescencyjnych pozwoliły na identyfikację specyficznych profili oporności nawet wtedy, gdy w jednej próbce obecnych było kilka szczepów C. auris. Jest to istotna przewaga nad dotychczasowymi metodami diagnostycznymi, które zazwyczaj wykrywają jedynie obecność patogenu w sposób zero-jedynkowy.

Diagnostyka cyfrowa nowej generacji

Zespół badaczy dodatkowo uprościł warunki reakcji, redukując wieloetapowy protokół do autonomicznej reakcji typu „one-pot”. Aby w pełni wykorzystać potencjał dSHERLOCK, opracowano również dedykowany pipeline analityczny, oparty na algorytmach uczenia maszynowego, umożliwiający przekształcenie ogromnej liczby danych fluorescencyjnych w wyniki zrozumiałe i użyteczne klinicznie. Jak podkreślają autorzy, pojedyncza mikromacierza zawiera około 18 tysięcy mikrokanałów, z których wiele obejmuje pojedynczą cząsteczkę docelową C. auris, co pozwala na niezwykle precyzyjną analizę obecności patogenu, nasilenia zakażenia oraz jego zmienności genetycznej.

„Możliwości, które wprowadzamy dzięki dSHERLOCK, spełniają kluczowe wymagania kliniczne wobec testów nowej generacji: szybkość, ilościowość oraz zdolność do oceny krajobrazu oporności przeciwdrobnoustrojowej w indywidualnych próbkach pacjentów” – podsumowuje James Collins. David Walt zwraca natomiast uwagę, że platforma dSHERLOCK ma potencjał znacznie wykraczający poza diagnostykę C. auris i może zostać zaadaptowana do wykrywania oraz charakteryzowania wielu innych patogenów stanowiących istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego.

Znaczenie interdyscyplinarnej współpracy podkreśla również Donald Ingber, MD, PhD, wskazując, że konwergencja technologii CRISPR, detekcji pojedynczych cząsteczek oraz sztucznej inteligencji stanowi przykład skutecznego odpowiadania na pilne, niezaspokojone potrzeby kliniczne o potencjalnie ogromnym wpływie na system opieki zdrowotnej.

Źródło: Nature Biomedical Engineering