Zaawansowane obrazowanie fluorescencyjne i tomografia krioelektronowa w badaniu zmian strukturalnych kapsydu HIV-1
Najnowsza praca zespołu naukowców z The Salk Institute for Biological Sciences, Florida State University, Emory University School of Medicine oraz The Scripps Research Institute przedstawia nowatorskie podejście do analizy dynamiki kapsydu HIV-1. Publikacja ukazała się w czasopiśmie ACS Nano (2025) i została przygotowana przez m.in. dr Zaidę K. Rodriguez, dr Dmitry’ego Lyumkisa, dr Gregory’ego B. Melikyana i dr Ashwantha C. Francisa.
Tło badań
Kapsyd HIV-1 pełni kluczową rolę w cyklu replikacyjnym wirusa, chroniąc materiał genetyczny i jednocześnie umożliwiając transport kompleksu wirusowego do jądra komórkowego. Jego odkapsydowanie (uncoating) jest procesem krytycznym, a jednocześnie słabo poznanym. Nowe leki przeciwwirusowe, takie jak lenakapawir (LEN), ingerują w strukturę kapsydu, stabilizując go lub zmieniając dynamikę jego rozpadu. Drugim istotnym czynnikiem badanym w pracy był metabolit komórkowy heksafosforan inozytolu (IP6), który również wpływa na stabilność kapsydu.
Metodyka
Badacze opracowali zintegrowany workflow CLEM (korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej), łączący:
- czasowo rozdzielcze obrazowanie fluorescencyjne (mikroskopia fluorescencyjna), pozwalające śledzić w czasie utratę znaczników kapsydu,
- krioelektronową tomografię (cryo-ET), umożliwiającą analizę ultrastruktury kapsydów.
Kluczowe innowacje obejmowały:
- Immunoafinityczne wychwytywanie cząstek HIV-1 na siatkach krio-EM, co pozwalało mapować położenie wirionów przed zamrożeniem próbki.
- Wykorzystanie różnej wielkości znaczników fluorescencyjnych w celu precyzyjnego nakładania obrazów fluorescencyjnych i elektronowych.
Takie podejście zwiększyło skuteczność korelacji obrazów do około 80%, co jest bardzo wysokim wynikiem w tego typu eksperymentach.
Analiza wykazała, że:
- IP6 stabilizuje kapsydy o morfologii stożkowej, utrzymując ich integralność.
- Lenakapawir prowadzi do powstania otwartych struktur kapsydu, które tracą charakterystyczne zakrzywione końce. Często obserwowano fragmentację i powstawanie płaskich arkuszy sieci kapsydu.
- Dzięki metodzie CLEM możliwe było bezpośrednie powiązanie dynamiki utraty znaczników fluorescencyjnych z obrazami ultrastrukturalnymi kapsydów na poziomie pojedynczych wirionów.
W próbach z obrazowaniem czasowo rozdzielczym udało się uchwycić trzy etapy odkapsydowania:
- utrata znacznika iGFP z przestrzeni pomiędzy kapsydem a błoną wirusa,
- początkowe otwieranie kapsydu,
- całkowite odkapsydowanie, widoczne jako utrata sygnałów zarówno iGFP, jak i CDR.
Znaczenie badań
Opracowany workflow stanowi dowód koncepcji, umożliwiający badanie dynamiki kapsydów HIV-1 na poziomie ultrastrukturalnym i molekularnym. Może on być wykorzystany nie tylko do analizy działania leków, takich jak lenakapawir, ale również do badania innych wirusów i ich odpowiedzi na czynniki terapeutyczne czy metabolity komórkowe.
Badanie dostarcza nowych danych na temat odmiennych mechanizmów stabilizacji kapsydu przez IP6 i lenakapawir oraz wskazuje, że leki stabilizujące kapsyd mogą paradoksalnie prowadzić do jego strukturalnego uszkodzenia.
Źródło
ACS Nano – Time-Resolved Fluorescence Imaging and Correlative Cryo-Electron Tomography to Study Structural Changes of the HIV-1 Capsid
DOI: 10.1021/acsnano.5c06724
