Ewolucja Mycobacterium abscessus w organizmie gospodarza może zmieniać biofilm i morfologię kolonii

Mycobacterium abscessus należy do najtrudniejszych klinicznie prątków niegruźliczych, m.in. ze względu na zdolność do długotrwałego utrzymywania się w organizmie, zmiany morfotypu kolonii oraz tworzenia biofilmu. Naukowcy z Chulalongkorn University w Bangkoku przeanalizowali 58 izolatów klinicznych, łącząc ocenę fenotypu biofilmu z sekwencjonowaniem całogenomowym. Wyniki wskazują, że przejście do morfotypu szorstkiego jest silnie związane z zaburzeniami genów odpowiadających za syntezę glikopeptydolipidów, natomiast osłabienie tworzenia biofilmu może wiązać się z bardziej złożonymi zmianami obejmującymi szlaki odpowiedzi na stres, metabolizm i transport błonowy.

Jak przeprowadzono badanie klinicznych izolatów M. abscessus

Pracę przygotowali Nachat Chirabandhu, Azizah Fitriana Nurul Ilmi oraz Suwatchareeporn Rotcheewaphan. Autorzy są związani z Faculty of Medicine, Chulalongkorn University w Bangkoku. Chirabandhu reprezentuje Biomedical Sciences and Biotechnology Program, Ilmi – Medical Sciences Program, natomiast Rotcheewaphan – Department of Microbiology oraz Center of Excellence in Systems Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University.

Materiał badawczy obejmował 58 klinicznych izolatów Mycobacterium abscessus pobranych od 36 pacjentów bez mukowiscydozy leczonych w King Chulalongkorn Memorial Hospital w Bangkoku w latach 2017–2020. Spośród wszystkich izolatów 42, czyli 72,4%, pochodziły z materiału związanego z układem oddechowym, a 16, czyli 27,6%, z materiału pozapłucnego.

Analizy WGS i średniej identyczności nukleotydowej pozwoliły przypisać izolaty do trzech podgatunków. Najczęściej występował M. abscessus subsp. abscessus – 39 izolatów, czyli 67,2%. M. abscessus subsp. massiliense reprezentowało 13 izolatów, czyli 22,4%, a subsp. bolletii – 6 izolatów, czyli 10,3%.

Pod względem morfologii kolonii 33 izolaty miały morfotyp szorstki, a 25 – gładki. W obrębie subsp. abscessus dominował morfotyp szorstki: dotyczył 25 z 39 izolatów. W subsp. massiliense częściej obserwowano morfotyp gładki – 8 z 13 izolatów. W przypadku sześciu izolatów subsp. bolletii oba morfotypy występowały równie często.

Pomiar biofilmu i analiza genomowa

Zdolność bakterii do tworzenia biofilmu oceniano w 96-dołkowych płytkach polistyrenowych. Po pięciu dniach inkubacji przylegającą biomasę barwiono 0,1-procentowym fioletem krystalicznym, a następnie oznaczano absorbancję przy długości fali 590 nm. Równolegle mierzono całkowitą biomasę bakteryjną przy OD₆₀₀, aby ocenić, czy różnice w ilości biofilmu mogą być wyjaśnione po prostu różnicami we wzroście bakterii.

Każdy eksperyment przeprowadzano w pięciu powtórzeniach technicznych i trzech biologicznych. Izolaty klasyfikowano jako słabych, umiarkowanych lub silnych producentów biofilmu na podstawie wartości granicznej wyprowadzonej z wyników kontroli ujemnych.

Dane z sekwencjonowania całogenomowego analizowano z wykorzystaniem m.in. mapowania do genomu referencyjnego M. abscessus ATCC 19977, identyfikacji SNP, insercji i delecji, wariantów strukturalnych, analizy pan-genomu oraz rekonstrukcji filogenetycznej na podstawie SNP rdzeniowego genomu. Oceniano zarówno niewielkie mutacje punktowe, jak i znacznie większe rearanżacje genomowe.

Morfotyp gładki wiązał się z większą biomasą biofilmu

Wśród 58 badanych izolatów 24, czyli 41,4%, zaklasyfikowano jako silnych producentów biofilmu. Kolejne 30 izolatów – 51,7% – tworzyło biofilm w stopniu umiarkowanym. Jedynie cztery izolaty, stanowiące 6,9% kolekcji, należały do słabych producentów biofilmu.

Zakres wartości OD₅₉₀ wynosił od 0,118 do 0,915. Izolaty o morfotypie gładkim tworzyły istotnie większą biomasę biofilmu niż izolaty szorstkie – różnica osiągnęła istotność statystyczną przy p = 0,006.

W grupie izolatów szorstkich najczęściej obserwowano umiarkowane tworzenie biofilmu: dotyczyło ono 20 izolatów, czyli 60,6%. Dziesięć izolatów szorstkich – 30,3% – należało jednak do silnych producentów, a tylko trzy, czyli 9,1%, do słabych producentów.

Wśród izolatów gładkich proporcje były odmienne. Czternaście z 25 izolatów, czyli 56,0%, było silnymi producentami biofilmu, dziesięć – 40,0% – umiarkowanymi, a jeden – 4,0% – słabym producentem.

Co istotne, całkowity wzrost bakterii nie był istotnie związany ze stopniem tworzenia biofilmu (p = 0,13). Autorzy interpretują to jako wskazanie, że obserwowane różnice w biomasie biofilmu nie były po prostu pochodną szybszego lub wolniejszego namnażania się poszczególnych izolatów. Nie wykazano również istotnych różnic w biomasie biofilmu pomiędzy trzema podgatunkami ani w zależności od tego, czy izolat pochodził z materiału płucnego czy pozapłucnego.

Mutacje w locus GPL a przejście do morfotypu szorstkiego

Jednym z najważniejszych elementów pracy była analiza genów uczestniczących w biosyntezie i transporcie glikopeptydolipidów – GPL. Cząsteczki te są istotnym składnikiem powierzchni komórki M. abscessus i odgrywają zasadniczą rolę w kształtowaniu morfotypu kolonii.

Autorzy wykryli w izolatach szorstkich mutacje utraty funkcji obejmujące geny gap, mps1, mps2, mmpL4b oraz fadE5. Szczególnie wyraźny związek z morfotypem szorstkim dotyczył kluczowych genów biosyntezy GPL: mps1 oraz mps2. Dla mutacji utraty funkcji w mps1 wartość p wynosiła <0,001, natomiast dla mps2 – 0,014.

Zmiany genetyczne były bardzo zróżnicowane. W mps1 występowały mutacje wprowadzające przedwczesne kodony stop oraz insercje i delecje powodujące przesunięcie ramki odczytu. Podobne mutacje utraty funkcji wykryto w mps2. Zmiany obejmowały również system transportu GPL, m.in. gen mmpL4b.

Niektóre izolaty miały znacznie większe delecje genomowe. W izolacie Mab20 stwierdzono delecję około 24 kb obejmującą dziewięć genów locus GPL. W izolacie Mab19 wykazano delecję długości 2653 par zasad obejmującą mps1.

Nie jeden wariant, lecz wiele niezależnych dróg

Mutacje nie skupiały się w jednym charakterystycznym „hotspocie”. Nie znaleziono również identycznych mutacji utraty funkcji współdzielonych przez izolaty pochodzące od różnych pacjentów lub należące do różnych klastrów filogenetycznych.

To ważna obserwacja z perspektywy mikroewolucji patogenu. Sugeruje bowiem, że morfotyp szorstki może pojawiać się wielokrotnie i niezależnie w wyniku różnych zmian uszkadzających ten sam funkcjonalny układ biosyntezy lub transportu GPL.

Analiza izolatów pobieranych sekwencyjnie od pacjentów 1 i 5 dokumentowała przejście od morfotypu gładkiego do szorstkiego. W późniejszych izolatach stwierdzano zmiany obejmujące m.in. mutację nonsensowną w gap oraz delecję w mps2. Wyniki wspierają koncepcję spontanicznej adaptacji genomowej zachodzącej podczas utrzymywania się zakażenia.

Jednocześnie trzy izolaty szorstkie – Mab12, Mab51 i Mab80 – nie zawierały mutacji utraty funkcji w analizowanym locus GPL. Autorzy zwracają uwagę, że oznacza to prawdopodobne istnienie dodatkowych, niezależnych od klasycznych mutacji GPL mechanizmów prowadzących do zmiany morfotypu.

Genomika izolatów słabo tworzących biofilm

Szczególnej analizie poddano cztery izolaty o najmniejszej zdolności tworzenia biofilmu: Mab17, Mab39, Mab50 oraz Mab69. Porównywano ich genomy z genomami blisko spokrewnionych izolatów o umiarkowanym lub silnym fenotypie biofilmowym. Pozwoliło to wyselekcjonować zmiany obecne wyłącznie w słabych producentach.

lat i odpowiedź na stres metaboliczny

W izolacie Mab50 wykryto mutację przesunięcia ramki odczytu p.Val287fs w genie lat – mab_3646c – kodującym L-lizynową 6-transaminazę. Mab50 charakteryzował się najmniejszą biomasą biofilmu spośród sześciu kolejnych izolatów uzyskanych od pacjenta 7.

Autorzy zwracają uwagę, że LAT jest konserwowanym enzymem prątków związanym z adaptacją do niedoboru składników odżywczych i stanów spoczynkowych. Na podstawie wcześniejszych badań innych prątków można hipotetyzować, że zaburzenie tej ścieżki wpływa na odpowiedź stresową i metabolizm niezbędny podczas dojrzewania biofilmu. W analizowanej pracy nie przeprowadzono jednak eksperymentalnego potwierdzenia takiego mechanizmu w M. abscessus.

Rozległa przebudowa genomu izolatu Mab39

Najbardziej rozbudowany zestaw zmian wykryto w Mab39. Izolat zawierał delecję o wielkości około 37,6 kb obejmującą 35 genów, od mab_4342c do mab_4376c. Region ten obejmował geny związane m.in. z metabolizmem, przemianami lipidów, regulacją i adaptacją do stresu.

Dodatkowo stwierdzono mutacje przesunięcia ramki odczytu w mspA – mab_2800 – kodującym porinę z rodziny MspA, w mab_4599c związanym z białkiem transportu lipidów z rodziny MlaD oraz w pyrE – mab_4260c – uczestniczącym w biosyntezie nukleotydów.

Analiza pan-genomu wykazała jednocześnie nabycie genów dodatkowych, obejmujących elementy związane z fagami, białka wiążące DNA oraz komponenty związane z systemem ESX-1. Zdaniem badaczy świadczy to o znacznej plastyczności genomowej tego izolatu.

atsA oraz geny o nieustalonej funkcji

W Mab69 wykryto m.in. mutację frameshift w atsA – mab_4307. Gen ten ma kodować arylosulfatazę i może uczestniczyć w metabolizmie siarki oraz adaptacji do warunków ograniczonej dostępności składników odżywczych. Zmiana ta nie występowała w wcześniejszym, umiarkowanie tworzącym biofilm izolacie Mab29 należącym do tej samej serii longitudinalnej.

Badacze wykryli również mutacje w genach kodujących białka o nieznanych funkcjach, m.in. mab_0030, mab_0211, mab_0212 i mab_4818. Ich udział w regulacji biofilmu pozostaje hipotezą wymagającą badań funkcjonalnych.

Interesujące jest również to, czego w analizowanej kolekcji nie znaleziono. Wśród kandydackich determinant słabego biofilmu nie wykryto mutacji w kilku dobrze znanych genach wcześniej wiązanych z tworzeniem biofilmu przez prątki, takich jak lsr2, groEL1 czy mmpL3. Może to wskazywać, że kliniczne izolaty wykorzystują znacznie bardziej zróżnicowane szlaki adaptacji niż sugerowałyby modele oparte na pojedynczych genach.

Niezależna ewolucja bakterii podczas zakażenia

Analiza filogenetyczna oparta na SNP rdzeniowego genomu jednoznacznie rozdzieliła badane izolaty na trzy podgatunki M. abscessus. Przy zastosowaniu progu mniej niż 10 SNP autorzy wyróżnili 12 klastrów: siedem obejmowało blisko spokrewnione izolaty pochodzące od różnych pacjentów, a pięć obejmowało kolejne izolaty pobrane od pojedynczych pacjentów. Dodatkowo 12 izolatów występowało jako singletony.

Rozmieszczenie morfotypów i zdolności tworzenia biofilmu na drzewie filogenetycznym wskazywało, że oba fenotypy nie były prostą cechą konkretnej linii klonalnej. Autorzy nie znaleźli cech genetycznych specyficznych dla jednej linii, które wyjaśniałyby stopień tworzenia biofilmu.

W połączeniu z różnorodnością mutacji locus GPL dane sugerują powtarzalne, niezależne pojawianie się zmian prowadzących do podobnego fenotypu. Jest to zgodne z modelem ewolucji konwergentnej, w którym różne warianty genetyczne mogą zakłócać te same szlaki biologiczne i prowadzić do podobnego efektu – np. utraty glikopeptydolipidów i przejścia do morfotypu szorstkiego.

Z punktu widzenia biologii zakażenia szczególnie ważne są obserwacje z izolatów pobieranych kolejno od tych samych pacjentów. Pokazują one, że genom M. abscessus może zmieniać się już podczas utrzymywania się bakterii w gospodarzu, a kolejne populacje bakteryjne mogą różnić się zarówno morfologią kolonii, jak i zdolnością tworzenia biofilmu.

Znaczenie wyników i ograniczenia badania

Badanie rozszerza wiedzę o związku pomiędzy genomem M. abscessus a dwoma fenotypami ważnymi dla biologii tego patogenu: zmianą morfotypu kolonii oraz tworzeniem biofilmu. Szczególnie silne dane dotyczą zależności pomiędzy zaburzeniami genów biosyntezy i transportu GPL a morfotypem szorstkim.

Jednocześnie związek pomiędzy genomem a ilością biofilmu okazuje się bardziej złożony. Brak jednego wspólnego zestawu mutacji u czterech słabych producentów wskazuje, że osłabienie biofilmu może powstawać w następstwie zmian w wielu różnych procesach – odpowiedzi na stres, metabolizmie, transporcie przez błony, metabolizmie lipidów czy regulacji ekspresji genów.

Warto przy tym podkreślić pozorny paradoks wyników. Chociaż izolaty gładkie wytwarzały przeciętnie więcej biofilmu, większość izolatów szorstkich nadal była zdolna do umiarkowanego lub silnego tworzenia biofilmu. Utrata GPL nie oznacza więc automatycznie utraty tego fenotypu. Autorzy sugerują, że może raczej zmieniać skład i architekturę biofilmu niż całkowicie blokować jego powstawanie.

W praktyce klinicznej

Uzyskane wyniki mają obecnie przede wszystkim znaczenie mechanistyczne i mikrobiologiczne. Pokazują, dlaczego nawet blisko spokrewnione izolaty M. abscessus mogą wykazywać odmienne właściwości fenotypowe i jak istotną rolę może odgrywać ewolucja bakterii zachodząca podczas przewlekłego zakażenia.

Z perspektywy przyszłych badań szczególnie interesujące będzie eksperymentalne odtworzenie opisanych mutacji i sprawdzenie ich bezpośredniego wpływu na tworzenie biofilmu, tolerancję na antybiotyki, przeżywalność w komórkach gospodarza oraz zdolność do wywoływania odpowiedzi zapalnej. Dopiero takie dane pozwolą ustalić, które spośród wykrytych zmian są rzeczywistymi determinantami fenotypu, a które jedynie współwystępują z nim w analizowanych izolatach.