Blisko spokrewnione klony Pseudomonas aeruginosa ST357 i ST274 wykryte u pacjentów z mukowiscydozą

Analiza izolatów Pseudomonas aeruginosa pobranych od chorych na mukowiscydozę leczonych w regionalnym ośrodku referencyjnym w brazylijskiej Amazonii wykazała bliskie pokrewieństwo części szczepów należących do wysokiego ryzyka klonów ST357 i ST274. Badacze stwierdzili zarówno bardzo podobne profile PFGE u różnych pacjentów, jak i identyczne profile utrzymujące się przez kilka miesięcy u jednego chorego. Jednocześnie wszystkie badane izolaty spełniały kryteria wielolekooporności w badaniu metodą dyfuzyjno-krążkową, a porównanie z systemem VITEK 2 ujawniło istotne rozbieżności w klasyfikacji lekowrażliwości, szczególnie w przypadku antybiotyków beta-laktamowych.

Dlaczego ST357 i ST274 wymagają uwagi epidemiologicznej?

Przewlekłe i nawracające zakażenia dróg oddechowych wywoływane przez Pseudomonas aeruginosa pozostają jednym z najważniejszych problemów mikrobiologicznych u osób z mukowiscydozą. Szczególne znaczenie mają tzw. high-risk clones, czyli linie klonalne o zdolności do szerokiego rozprzestrzeniania się, niejednokrotnie związane z opornością na wiele grup antybiotyków oraz określonymi determinantami wirulencji.

Autorzy pracy opublikowanej w Indian Journal of Medical Microbiology skupili się na dwóch takich typach sekwencyjnych – ST357 oraz ST274. W poprzednio scharakteryzowanej kohorcie pacjentów z mukowiscydozą z brazylijskiej Amazonii były to jedyne linie wysokiego ryzyka wykrywane u więcej niż jednego chorego. Samo stwierdzenie tego samego sequence type za pomocą MLST nie pozwala jednak przesądzić, czy izolaty pochodzące od różnych osób są rzeczywiście blisko spokrewnionymi szczepami.

Dlatego badacze zastosowali PFGE – elektroforezę pulsacyjną w zmiennym polu elektrycznym – pozwalającą uzyskać bardziej szczegółowy „odcisk palca” genomowego bakterii i ocenić podobieństwo między poszczególnymi izolatami. Celem było ustalenie, czy powtarzające się wykrywanie ST357 i ST274 u różnych pacjentów może odpowiadać niezależnemu nabywaniu odmiennych szczepów należących do tych samych linii, czy też dotyczy izolatów wykazujących bliskie pokrewieństwo klonalne.

Autorzy i ośrodki związane z badaniem

Wśród autorów publikacji znaleźli się m.in. Maria Isabel Montoril Gouveia, Edilene do Socorro Nascimento Falcão Sarges, Emanoele Saraiva Pereira, Jonatan Carlos Cardoso da Silva, Emilly Victória Correia de Miranda, Ana Beatriz Tavares Duarte, Pabllo Antonny Silva dos Santos, Carolynne Silva dos Santos, Herald Souza dos Reis, Danielle Murici Brasiliense, Cintya de Oliveira Souza, Karla Valéria Batista Lima oraz Yan Corrêa Rodrigues.

Praca jest związana z działalnością badawczą Evandro Chagas Institute (IEC) w Brazylii. Badanie finansował Evandro Chagas Institute (IEC/PA), natomiast stypendia badaczy były finansowane przez Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) oraz National Council for Scientific and Technological Development (CNPq). Autorzy wskazują także, że projekt stanowi część pracy magisterskiej Maria Isabel Montoril Gouveia prowadzonej w Program in Epidemiology and Health Surveillance (PPGEVS), Evandro Chagas Institute (IEC), Ministry of Health, Brazil.

Materiał pochodził od pacjentów pozostających pod opieką regionalnego ośrodka referencyjnego mukowiscydozy w Belém. Protokół pierwotnego badania został zatwierdzony przez Research Ethics Committee of HUJBB/UFPA, czyli komisję etyczną João de Barros Barreto University Hospital / Federal University of Pará. W przedstawionej obecnie pracy przeprowadzono wtórną analizę laboratoryjną wcześniej zebranych, zanonimizowanych izolatów układu oddechowego, bez ponownego pobierania materiału od pacjentów.

Jak przeprowadzono analizę PFGE i lekowrażliwości?

Podstawę badania stanowiła wcześniej opisana kolekcja izolatów P. aeruginosa pochodzących z dróg oddechowych pacjentów z mukowiscydozą. W badanym okresie ośrodek prowadził 136 aktywnych pacjentów, z których 44 spełniło ostateczne kryteria włączenia do wcześniejszej analizy. Kolekcja typowana metodą MLST obejmowała 72 izolaty od 44 osób.

Do obecnej analizy początkowo wybrano siedem izolatów ST357 i dziewięć ST274. Ponieważ od jednego pacjenta dostępne były dwa izolaty ST274 pobrane tego samego dnia, jeden z nich wybrano losowo. Ostatecznie do PFGE trafiło 15 izolatów pochodzących od 14 pacjentów: siedem ST357 i osiem ST274.

PFGE jako narzędzie oceny pokrewieństwa szczepów

Komórki bakteryjne zatapiano w bloczkach agarozy o niskiej temperaturze topnienia, a genomowe DNA uwalniano przez lizę in situ. Następnie DNA trawiono enzymem restrykcyjnym XbaI przez 18–24 godziny w temperaturze 37°C. Fragmenty rozdzielano w 1-procentowym żelu agarozowym z wykorzystaniem systemu CHEF-DR III przez 19 godzin w temperaturze 14°C.

Uzyskane profile analizowano w BioNumerics v6.5. Podobieństwo wzorów prążków obliczano przy użyciu współczynnika Dice’a, a klastry tworzono metodą UPGMA. Autorzy przyjęli próg co najmniej 80% podobieństwa jako kryterium pokrewieństwa klonalnego. Profile nierozróżnialne, czyli wykazujące 100% podobieństwa, traktowano jako ten sam typ PFGE.

Dziewięć leków przeciwpseudomonasowych

Badanie lekowrażliwości powtórzono metodą Kirby’ego-Bauera na podłożu Mueller-Hinton. Oceniono dziewięć leków należących do sześciu kategorii przeciwdrobnoustrojowych: piperacylinę z tazobaktamem, ceftazydym, ceftazydym z awibaktamem, cefepim, aztreonam, imipenem, meropenem z waborbaktamem, amikacynę oraz cyprofloksacynę.

Wyniki interpretowano przede wszystkim według kryteriów CLSI, a dla meropenemu z waborbaktamem zastosowano kryteria BrCAST. Wielolekooporność MDR definiowano jako brak wrażliwości na co najmniej jeden lek z co najmniej trzech kategorii antybiotyków.

Dla antybiotyków ocenianych zarówno automatycznie, jak i metodą dyfuzyjno-krążkową porównano klasyfikacje VITEK 2 z wynikami dyfuzji krążkowej, którą w tej analizie przyjęto jako metodę porównawczą. Analizowano zgodność kategorialną oraz rozbieżności typu very major error, major error i minor error.

Pokrewieństwo klonalne ST357 i ST274

Badani pacjenci mieli od 1 do 27 lat, a średnia wieku wynosiła 11,6 roku. Jedenaście spośród 14 osób było płci męskiej. Pacjenci pochodzili z wielu miejscowości w stanach Pará, Amapá i Maranhão, jednak wszyscy korzystali z opieki tego samego ośrodka referencyjnego w Belém.

U 11 z 14 pacjentów zakażenie w momencie pobrania materiału klasyfikowano jako okresowe, natomiast u trzech jako przewlekłe. Wszystkie trzy przewlekłe zakażenia dotyczyły ST274. Marker wirulencji exoU wykryto we wszystkich siedmiu izolatach ST357, natomiast w ST274 występował on znacznie rzadziej – w dwóch z ośmiu badanych izolatów.

ST357: bardzo podobne podgrupy u różnych pacjentów

Siedem izolatów ST357 pochodziło od siedmiu różnych pacjentów. Dla całej grupy podobieństwo PFGE wynosiło 73,6%, jednak wewnątrz niej występowały podgrupy o podobieństwie przekraczającym 88%. Co szczególnie istotne, badacze zidentyfikowali dwie pary izolatów o nierozróżnialnych profilach PFGE, czyli ze 100-procentowym podobieństwem.

Oznacza to, że mimo pewnego zróżnicowania całej populacji ST357 u poszczególnych chorych występowały bakterie o bardzo bliskim pokrewieństwie. Autorzy interpretują ten obraz jako zgodny z niedawnym wspólnym pochodzeniem niektórych izolatów, ale nie jako bezpośredni dowód transmisji pomiędzy konkretnymi pacjentami.

ST274: spójny klaster obejmujący różnych pacjentów

Osiem izolatów ST274 pochodziło od siedmiu pacjentów. W przeciwieństwie do bardziej podzielonego ST357 tworzyły one spójny klaster z ogólnym podobieństwem PFGE wynoszącym 80,2%, a więc przekraczającym przyjęty przez autorów próg pokrewieństwa klonalnego.

U jednego pacjenta, oznaczonego w badaniu jako P28, dostępne były dwa izolaty ST274 pobrane w odstępie pięciu miesięcy. Ich profile PFGE były identyczne. Wynik ten jest zgodny z krótkoterminową stabilnością szczepu w obrębie jednego gospodarza.

Obserwacje te są epidemiologicznie istotne, ponieważ pacjenci pochodzili z różnych miejscowości, ale byli objęci opieką tego samego programu mukowiscydozy. Nie pozwala to jednak ustalić, czy bakterie przenosiły się między pacjentami, czy też chorzy mieli kontakt ze wspólnym rezerwuarem środowiskowym albo innym, niezidentyfikowanym źródłem.

Wielolekooporność i rozbieżności między VITEK 2 a dyfuzją krążkową

Drugim kluczowym elementem badania była ocena fenotypu oporności. W metodzie dyfuzyjno-krążkowej wszystkie 15 izolatów spełniło kryteria MDR. Jednocześnie wrażliwość na ceftazydym z awibaktamem oraz cyprofloksacynę stwierdzono u wszystkich 15 izolatów.

Meropenem z waborbaktamem pozostawał aktywny wobec wszystkich 11 izolatów, dla których dostępny był wynik; w czterech przypadkach nie uzyskano raportowanej klasyfikacji. W przypadku amikacyny 11 z 14 izolatów z dostępnym wynikiem sklasyfikowano jako wrażliwe.

Różne profile ST274 i ST357

W grupie ST274 szczególnie widoczna była oporność na imipenem – 62,5% izolatów sklasyfikowano jako oporne. Dla cefepimu 75% izolatów otrzymało kategorię pośrednią, a wszystkie izolaty ST274 ocenione wobec piperacyliny z tazobaktamem znalazły się w kategorii pośredniej.

W ST357 wyniki dla imipenemu najczęściej mieściły się w kategorii pośredniej. Oporność na cefepim stwierdzono u 42,9% izolatów, natomiast na piperacylinę z tazobaktamem u 57,1%. Amikacyna i meropenem z waborbaktamem zachowały aktywność wobec wszystkich badanych w tym zakresie izolatów ST357.

VITEK 2 i dyfuzja krążkowa dawały odmienne klasyfikacje

Najbardziej niepokojącym diagnostycznie wynikiem była niska zgodność kategorialna obu metod dla kilku antybiotyków beta-laktamowych. Dla amikacyny zgodność kategorialna wyniosła 85,7%, natomiast dla ceftazydymu 0%, cefepimu 6,7%, imipenemu 13,3%, a piperacyliny z tazobaktamem 0%.

W przypadku cefepimu trzy spośród pięciu izolatów opornych w dyfuzji krążkowej zostały sklasyfikowane przez VITEK 2 jako wrażliwe. Odpowiadało to 60% wyników opornych w metodzie porównawczej. Dla imipenemu analogiczna rozbieżność wystąpiła w czterech z sześciu wyników opornych, czyli w 66,7%, natomiast dla piperacyliny z tazobaktamem w dwóch z czterech, czyli w 50%.

W przypadku ceftazydymu wszystkie 15 par wyników było niezgodnych kategorialnie, ale rozbieżności dotyczyły kategorii pośredniej. Dla cyprofloksacyny nie porównywano VITEK 2 z dyfuzją krążkową, ponieważ dostępne były dwa powtórzone badania metodą dyfuzyjno-krążkową. Ich zgodność wyniosła 80%.

System automatyczny zaniżał kategorię wielolekooporności

Jeszcze większą różnicę stwierdzono po zagregowaniu wyników do kategorii fenotypu oporności. Dyfuzja krążkowa zakwalifikowała jako MDR wszystkie 15 izolatów. VITEK 2 sklasyfikował jako MDR tylko dwa z nich. Oznaczało to zgodność całego profilu oporności na poziomie zaledwie 13,3%.

W 13 z 15 przypadków system VITEK 2 przypisał izolatowi niższą kategorię oporności niż metoda dyfuzyjno-krążkowa: siedem izolatów zakwalifikowano jako ModR, a sześć jako MultiS. Dla ST274 zgodność fenotypu wynosiła 25% – dwa z ośmiu izolatów. W grupie ST357 nie stwierdzono zgodności dla żadnego z siedmiu izolatów.

Znaczenie epidemiologiczne, ograniczenia i wnioski

Z epidemiologicznego punktu widzenia wyniki PFGE wskazują, że w badanym programie mukowiscydozy ST357 i ST274 nie były wyłącznie luźno zdefiniowanymi liniami MLST pojawiającymi się niezależnie u wielu pacjentów. W obrębie obu ST znaleziono izolaty wykazujące znaczne pokrewieństwo na poziomie profilu PFGE, a w ST357 nawet pary izolatów nierozróżnialnych.

Autorzy zwracają uwagę, że taki sygnał powinien prowadzić do wzmocnienia zasad zapobiegania zakażeniom specyficznych dla opieki nad chorymi na mukowiscydozę. W pracy wymieniono m.in. higienę rąk, stosowanie masek w placówkach ochrony zdrowia, organizację wizyt ograniczającą nakładanie się pobytu pacjentów i ich bliski kontakt oraz rygorystyczne zasady dekontaminacji sprzętu oddechowego lub – gdy jest to możliwe – jego stosowanie wyłącznie przez jednego pacjenta.

W sytuacji wykrywania blisko spokrewnionych izolatów uzasadnione może być również przeanalizowanie nakładania się terminów wizyt i hospitalizacji oraz, jeśli warunki na to pozwalają, molekularne porównanie izolatów klinicznych z drobnoustrojami pozyskanymi z potencjalnych rezerwuarów środowiskowych, takich jak umywalki, nebulizatory czy nawilżacze.

Badanie nie pozwala ustalić kierunku transmisji

Interpretacja wymaga jednak istotnej ostrożności. Analizowano niewielką liczbę izolatów pochodzących z jednego ośrodka, a materiał miał charakter przekrojowy i ograniczoną gęstość czasową. Nie przeprowadzono formalnego dochodzenia kontaktowego. Wprawdzie w równoległych projektach pobierano próbki ze środowiska poradni i domowego sprzętu oddechowego, jednak środowiskowych izolatów P. aeruginosa nie porównano molekularnie z izolatami klinicznymi wykorzystanymi w tej pracy.

PFGE jest metodą stosunkowo dostępną i użyteczną dla lokalnego typowania klonalnego, ale ma mniejszą rozdzielczość niż sekwencjonowanie całogenomowe. Nie dostarcza danych obejmujących cały genom i nie pozwala wiarygodnie rekonstruować kierunku transmisji. Autorzy wskazują dlatego WGS jako ważny element przyszłych badań.

Ograniczeniem części dotyczącej lekowrażliwości był również brak standaryzowanych wartości MIC oznaczonych metodą mikrorozcieńczeń w bulionie. Uniemożliwiło to powiązanie ilościowych wartości MIC z typami sekwencyjnymi lub profilami PFGE.

W praktyce klinicznej i epidemiologicznej

Badanie zwraca uwagę na dwa odrębne, ale wzajemnie powiązane problemy. Pierwszym jest możliwość lokalnego występowania blisko spokrewnionych klonów wysokiego ryzyka P. aeruginosa w populacji pacjentów z mukowiscydozą. Drugim – ryzyko istotnych różnic między metodami oznaczania lekowrażliwości, które mogą wpływać na sposób interpretowania zakresu oporności badanego izolatu.

Autorzy postulują okresowy nadzór genotypowy nad high-risk clones oraz wzmacnianie procedur kontroli zakażeń w ośrodkach mukowiscydozy. W przypadku klinicznie istotnych rozbieżności w automatycznych oznaczeniach lekowrażliwości wskazują na zasadność potwierdzania wyników za pomocą innej standaryzowanej metody.

Przyszłe badania powinny łączyć podłużne pobieranie materiału od pacjentów i ze środowiska z whole-genome sequencing oraz analizą więcej niż pojedynczej kolonii bakteryjnej. Takie podejście mogłoby lepiej odzwierciedlać heterogeniczność populacji P. aeruginosa w drogach oddechowych pacjentów z mukowiscydozą i umożliwić dokładniejsze odtworzenie potencjalnych dróg szerzenia się szczepów.