Indukowalna tolerancja Pseudomonas aeruginosa może zaburzać oznaczanie wrażliwości na kolistynę

Indukowalna tolerancja Pseudomonas aeruginosa na kolistynę może ujawniać się dopiero po wielu godzinach ekspozycji na antybiotyk, co komplikuje interpretację metod dyfuzyjnych stosowanych do oceny wrażliwości. W badaniu obejmującym szczep referencyjny PAO1, jego zmodyfikowane warianty oraz 10 izolatów klinicznych od chorych na mukowiscydozę autorzy obserwowali opóźniony odrost bakterii w strefach zahamowania wzrostu, analizowali ekspresję genów, mutacje, biofilm i dynamikę dyfuzji kolistyny. Wyniki wskazują, że zjawisko to jest związane z indukowalną tolerancją i zmianami mechanizmów modyfikacji lipopolisacharydu, a nie z heteroopornością.

Dlaczego oznaczanie wrażliwości na kolistynę jest szczególnym problemem?

Kolistyna należy do antybiotyków stosowanych wobec wieloopornych bakterii Gram-ujemnych, w tym Pseudomonas aeruginosa. Autorzy publikacji zwracają uwagę, że oznaczanie wrażliwości tego drobnoustroju na kolistynę metodami opartymi na dyfuzji w agarze jest problematyczne. W pracy przypomniano, że EUCAST i CLSI nie rekomendują dyfuzji krążkowej ani metod gradientowych, takich jak ETEST, do oznaczania wrażliwości bakterii Gram-ujemnych na kolistynę z powodu ryzyka uzyskiwania niewiarygodnych wyników.

Badacze skoncentrowali się jednak na dodatkowym zjawisku obserwowanym w izolatach P. aeruginosa pochodzących od chorych na mukowiscydozę. Po początkowym utworzeniu strefy zahamowania wzrostu w jej obrębie po dłuższej inkubacji pojawiały się ponownie kolonie bakterii. Odczyt wykonany przed pojawieniem się tego odrostu może więc wskazywać znacznie większą wrażliwość bakterii niż odczyt późniejszy.

Autorzy postawili hipotezę, że opóźniony wzrost jest konsekwencją indukowalnej tolerancji na kolistynę związanej ze zmianami lipopolisacharydu (LPS) i aktywacją układów regulacyjnych odpowiedzialnych za modyfikację lipid A.

Jak zaprojektowano badanie?

Autorami publikacji są Niels Høiby, Hengzhuang Wang, Kaj-Åge Henneberg, Tim Tolker-Nielsen, Doaa Higazy, Claus Moser, Ulla Rydahl Johansen oraz Oana Ciofu. Badacze reprezentowali Department of Clinical Microbiology, Rigshospitalet, Department of Immunology and Microbiology, Costerton Biofilm Center, Faculty of Health Sciences, University of Copenhagen oraz Biomedical Engineering, Department of Health Technology, Technical University of Denmark.

Do doświadczeń wykorzystano szczep referencyjny P. aeruginosa PAO1, trzy warianty PAO1 z inaktywowanymi pompami efflux oraz 10 izolatów klinicznych pochodzących od ośmiu duńskich chorych na mukowiscydozę. Dziewięć izolatów klinicznych pochodziło z płuc, z materiału plwocinowego, natomiast jeden z zatok przynosowych.

Izolaty wykorzystane w pracy pochodziły z lat 1996-2010. Autorzy opisali szeroki zestaw komplementarnych doświadczeń służących nie tylko porównaniu metod oznaczania wrażliwości, ale również wyjaśnieniu biologicznego mechanizmu opóźnionego odrostu.

Mikrorozcieńczenia w bulionie i ETEST

Jako metodę referencyjną oznaczania minimalnego stężenia hamującego (MIC) wykorzystano mikrorozcieńczenia w bulionie – broth microdilution (BMD). Badania prowadzono w kationowo skorygowanym Mueller-Hinton Broth. Standardowy odczyt wykonywano po 16-20 godzinach, jednak ze względu na wolny wzrost części izolatów pochodzących od chorych na mukowiscydozę konieczne było również powtórzenie odczytu po 24 i 48 godzinach.

ETEST wykonywano na kationowo skorygowanym agarze z krwią końską. Autorzy uzasadnili wybór bogatszego podłoża częstym wolnym wzrostem oraz możliwością występowania auksotrofii u izolatów P. aeruginosa od chorych na mukowiscydozę.

Dyfuzja krążkowa

W doświadczeniach z dyfuzją wykorzystano Neo-Sensitabs zawierające 10 µg lub 150 µg siarczanu kolistyny. Średnice stref zahamowania wzrostu oceniano w różnych punktach czasowych. Szczególną uwagę zwracano na pojawienie się kolonii w obrębie wcześniej widocznej strefy zahamowania.

Biofilm, krzywe wzrostu i analiza populacyjna

Minimalne stężenie eradykujące biofilm (MBEC) określano z wykorzystaniem Calgary Biofilm Device. Autorzy analizowali ponadto krzywe wzrostu PAO1 i sześciu izolatów klinicznych w płynnym podłożu zawierającym 1,5, 3,0 lub 6,0 µg/ml kolistyny.

Analizę populacyjną zastosowano w celu ustalenia, czy obserwowany odrost można wyjaśnić heteroopornością, czyli obecnością niewielkiej podpopulacji bakterii o stabilnie wyższym MIC.

Ekspresja genów i sekwencjonowanie

Autorzy przeprowadzili analizę ekspresji genów PAO1 podczas ekspozycji na kolistynę w warunkach tlenowych i beztlenowych. Wykorzystano również ilościowy RT-PCR do oceny ekspresji pmrA, phoP i parR.

Pełne sekwencjonowanie genomu wykonano dla par izolatów opornych i wrażliwych pochodzących od sześciu chorych. W pozostałych izolatach analizowano wybrane geny związane z tolerancją i opornością na kolistynę.

Co wykazało porównanie BMD, ETEST i dyfuzji krążkowej?

W przypadku PAO1 oraz ośmiu z 10 izolatów klinicznych wynik kategorycznej klasyfikacji uzyskany metodą BMD i ETEST był zgodny. Dwa izolaty zostały natomiast sklasyfikowane przez ETEST jako oporne przy jednoczesnej klasyfikacji jako wrażliwe w metodzie referencyjnej BMD. Autorzy określili te rozbieżności jako major error.

Jest to istotne rozróżnienie: nie jest to to samo zjawisko co fałszywa wrażliwość wskazana w tytule publikacji. W bezpośrednim porównaniu ETEST z BMD wspomniane dwa błędy polegały na fałszywym wskazaniu oporności. Problem fałszywej wrażliwości dotyczył natomiast sytuacji, w której strefę zahamowania wzrostu odczytywano przed pojawieniem się opóźnionego odrostu bakterii.

Odrost pojawiał się dopiero po dłuższej inkubacji

PAO1 nie wykazywał odrostu w strefach zahamowania wzrostu. Nie obserwowano go również w trzech wariantach PAO1 z inaktywowanymi pompami efflux mexAB-oprM, mexCD-oprJ i muxABC-opmB. Wynik ten przemawiał przeciwko wyjaśnianiu badanego zjawiska wyłącznie aktywnością tych pomp.

W wielu izolatach klinicznych obraz był odmienny. Po 24 godzinach w obrębie stref zahamowania wzrostu pojawiał się odrost, którego nie obserwowano w pierwszych godzinach inkubacji. W przykładowym izolacie PA735B/2010 MIC odczytany na podstawie pierwotnej strefy ETEST wynosił 8 µg/ml, natomiast po uwzględnieniu późniejszego odrostu przekraczał 256 µg/ml.

Autorzy określali drugi wynik jako wartość odnoszącą się do odrostu – regrowth-ETEST-MIC. W izolatach z takim zjawiskiem wartości związane z odrostem mogły być wielokrotnie wyższe niż początkowy odczyt.

Znaczenie ilości kolistyny w krążku

Modelowanie dyfuzji wykazało, że maksymalne stężenia osiągane przy krążku zawierającym 150 µg kolistyny były około 15-krotnie wyższe niż przy krążku 10 µg, co odpowiadało różnicy ilości antybiotyku w obu nośnikach.

Autorzy obserwowali bardzo małe, trudne do interpretacji strefy wokół krążków 10 µg. Na podstawie własnych doświadczeń uznali tę dawkę krążka za nieprzydatną do oznaczania wrażliwości P. aeruginosa na kolistynę. Należy jednak podkreślić, że jest to wniosek autorów z przeprowadzonych eksperymentów, a sama publikacja przypomina, że metody dyfuzyjne nie są rekomendowane przez EUCAST i CLSI do rutynowego oznaczania wrażliwości bakterii Gram-ujemnych na kolistynę.

Indukowalna tolerancja, LPS i odpowiedź genowa

Mechanizm działania kolistyny jest związany z oddziaływaniem z lipopolisacharydem bakterii Gram-ujemnych. Jednym z mechanizmów zmniejszających podatność P. aeruginosa na kolistynę jest modyfikacja lipid A przez dołączenie 4-amino-L-arabinozy (L-Ara4N). Zmiana ta zmniejsza ujemny ładunek powierzchni i osłabia elektrostatyczne oddziaływanie z dodatnio naładowaną cząsteczką kolistyny.

Według autorów indukowalna tolerancja różni się od stałej oporności mutacyjnej. Jest przejściową odpowiedzią zależną od ekspresji genów, uruchamianą pod wpływem antybiotyku i odwracalną po usunięciu ekspozycji.

PAO1 potrzebował wielu godzin na rozwinięcie tolerancji

W płynnym podłożu PAO1 eksponowany na 1,5 µg/ml kolistyny początkowo nie namnażał się. W warunkach tlenowych odrost rozpoczął się po około 13 godzinach, po czym tempo wzrostu zbliżyło się do kontroli. W warunkach beztlenowych wzrost był wolniejszy, a odrost rozpoczynał się po około 21-22 godzinach.

Przy wyższych stężeniach kolistyny, 3 i 6 µg/ml, PAO1 nie wykazywał analogicznego odrostu w czasie doświadczenia.

Badanie ekspresji genów wykazało podczas ekspozycji na kolistynę silną aktywację genów uczestniczących w modyfikacji LPS, w tym genów operonu arn oraz elementów dwuskładnikowego układu regulacyjnego pmrA/pmrB. Zjawisko obserwowano zarówno w warunkach tlenowych, jak i beztlenowych.

Tolerancja w izolatach od chorych na mukowiscydozę

Krzywe wzrostu analizowano dla sześciu izolatów klinicznych. Pięć z sześciu wykazywało zachowanie zgodne z indukowalną tolerancją podczas ekspozycji na 1,5, 3,0 i 6,0 µg/ml kolistyny. Izolaty te rosły wolniej wraz ze wzrostem stężenia antybiotyku, ale po okresie opóźnienia dochodziło do ponownego wzrostu.

Szósty izolat, PA40049/1996, zachowywał się odmiennie. Jego wzrost praktycznie nie był zaburzany przez zastosowane stężenia kolistyny, co autorzy interpretowali jako pełną oporność mutacyjną, a nie indukowalną tolerancję.

Biofilm dodatkowo zwiększał tolerancję

Badanie PAO1 pokazało również wyraźną zależność MBEC od wieku biofilmu. Wartość ta zwiększała się od około 2 µg/ml we wczesnej fazie wzrostu, poprzez 16 µg/ml po 3-5 godzinach, do 64 µg/ml po 7 godzinach i 256 µg/ml po 24 godzinach.

Autorzy rozdzielają w ten sposób dwa nakładające się mechanizmy: wzrost tolerancji związany z przejściem bakterii w tryb biofilmowy oraz indukowalną odpowiedź na samą ekspozycję na kolistynę.

Dlaczego autorzy wykluczają heterooporność jako główne wyjaśnienie?

Jednym z możliwych wyjaśnień późnego odrostu mogłaby być heterooporność, czyli sytuacja, w której w zasadniczo klonalnej populacji istnieje niewielka, stabilnie bardziej oporna subpopulacja.

Autorzy przeprowadzili dlatego analizę populacyjną dla sześciu izolatów klinicznych. Porównywano wzrost bakterii na podłożach zawierających rosnące stężenia kolistyny, a następnie wykonywano drugi cykl analizy z wykorzystaniem kolonii rosnących przy najwyższym tolerowanym stężeniu.

Uzyskane wyniki nie wskazywały, aby obserwowany odrost był konsekwencją selekcji niewielkiej, stabilnie opornej subpopulacji. Autorzy interpretują zjawisko jako opóźnioną odpowiedź obejmującą metabolicznie aktywną populację bakterii.

Zmiany genetyczne dotyczyły wielu elementów odpowiedzi na kolistynę

W sześciu izolatach wykonano sekwencjonowanie całogenomowe, natomiast w pozostałych analizowano wybrane geny związane z tolerancją i opornością. W poszczególnych izolatach wykrywano różne mutacje między innymi w genach należących do układów regulacyjnych i szlaków modyfikacji lub transportu LPS.

Wśród wymienianych w pracy genów znajdowały się m.in. phoQ, pmrB, oprH, lpxO2, parS, cprS, lptG i inne geny uczestniczące w regulacji odpowiedzi na kolistynę oraz strukturze lub transporcie lipopolisacharydu.

Autorzy podkreślają, że wzór mutacji był zróżnicowany pomiędzy izolatami. Nawet fenotypowo podobne izolaty pochodzące od tego samego chorego mogły zawierać odmienne zmiany w tych samych lub pokrewnych genach.

RT-PCR ujawnił szczególną odpowiedź jednego izolatu

Ekspresję pmrA, phoP i parR porównano w sześciu izolatach. W pięciu z nich autorzy nie stwierdzili istotnej różnicy pomiędzy materiałem eksponowanym i nieeksponowanym na kolistynę. Natomiast w bardzo wrażliwym izolacie PA4137/2007 obserwowano istotne zwiększenie ekspresji pmrA i parR podczas ekspozycji, co autorzy interpretowali jako adaptacyjną odpowiedź na kolistynę.

Znaczenie wyników i ograniczenia badania

Najważniejszym wnioskiem pracy jest wykazanie, że indukowalna tolerancja może w istotny sposób zmieniać obraz uzyskiwany w metodach dyfuzyjnych. Bakterie, których wzrost jest początkowo zahamowany, mogą po odpowiednio długiej ekspozycji uruchomić mechanizmy pozwalające na ponowne namnażanie w strefie zawierającej kolistynę.

Autorzy łączą to z czasem potrzebnym na indukcję ekspresji genów prowadzących do modyfikacji LPS oraz z obecnością mutacji wpływających na szlaki odpowiedzialne za tolerancję i oporność. Ich zdaniem wyjaśnia to przynajmniej część niewiarygodnych wyników uzyskiwanych przy użyciu dyfuzji krążkowej i ETEST.

W badaniu PAO1 w warunkach beztlenowych tolerancja ujawniała się później niż w warunkach tlenowych. Autorzy zwracają uwagę, że w przypadku bardzo wolno rosnących izolatów odczyt wykonany po standardowym czasie może nastąpić zanim indukowalna odpowiedź stanie się widoczna.

Na podstawie własnych wyników autorzy wskazują, że brak odrostu po 24 godzinach przemawia za wrażliwością izolatu na kolistynę, natomiast przy bardzo wolnym wzroście proponują ponowną obserwację po 48 godzinach. Wniosek ten należy rozumieć jako rezultat omawianej pracy laboratoryjnej, a nie jako zastąpienie obowiązujących standardów referencyjnego oznaczania wrażliwości na kolistynę.

Status publikacji

Publikacja została przyjęta do druku 25 września 2026 r. i udostępniona jako Journal Pre-proof. Oznacza to, że praca przeszła proces akceptacji, ale udostępniona wersja nie jest jeszcze ostateczną Version of Record i może podlegać dalszej redakcji, składowi oraz korekcie wydawniczej.