CRISPR-GRIT ma przyspieszyć badania nad opornością Candida albicans na leki przeciwgrzybicze

Naukowcy z University of Tennessee, Knoxville rozwijają technologie CRISPR-GRIT i FACT, które mają umożliwić znacznie szersze badanie funkcji genów grzybów, w tym Candida albicans. Jednym z kluczowych kierunków jest identyfikacja genów odpowiedzialnych za fenotyp oporności na leki przeciwgrzybicze. National Science Foundation oraz National Institutes of Health przyznały zespołowi ponad 1,3 mln dolarów na dalsze badania. Opublikowane wcześniej dane dotyczące CRISPR-GRIT pokazują, że platforma może upraszczać nokaut genów i wielokrotną edycję genomu diploidalnego C. albicans. Na obecnym etapie jest to jednak technologia badawcza, a nie metoda leczenia kandydozy u pacjentów.

Dlaczego oporność Candida albicans jest ważnym problemem badawczym?

Drożdżaki z rodzaju Candida mogą kolonizować organizm człowieka bez wywoływania choroby, m.in. w obrębie przewodu pokarmowego i skóry. W określonych warunkach, zwłaszcza u osób z zaburzeniami odporności lub innymi czynnikami predysponującymi, mogą jednak stać się przyczyną zakażenia. Szczególnie istotne klinicznie są zakażenia inwazyjne oraz zakażenia występujące u pacjentów hospitalizowanych.

Jednym z problemów współczesnej mykologii medycznej jest narastanie oporności grzybów na dostępne leki przeciwgrzybicze. W przypadku Candida albicans poznanie molekularnych podstaw tego zjawiska wymaga nie tylko sekwencjonowania genomu czy identyfikacji wariantów genetycznych, ale również odpowiedzi na pytanie, jaką funkcję pełnią poszczególne geny i jak ich zmiana wpływa na fenotyp komórki.

Właśnie w tym miejscu szczególnego znaczenia nabiera genomika funkcjonalna. Pozwala ona przejść od stwierdzenia, że określony gen występuje w genomie, do eksperymentalnej oceny, co stanie się z komórką po jego wyłączeniu, zmodyfikowaniu lub zmianie poziomu jego aktywności.

Jak działa CRISPR-GRIT?

Technologie CRISPR-Cas znacząco rozszerzyły możliwości celowanej modyfikacji genomu mikroorganizmów. W przypadku Candida albicans zastosowanie takich metod jest jednak bardziej skomplikowane niż w wielu klasycznych modelach laboratoryjnych. Jedną z przyczyn jest diploidalność genomu tego gatunku – komórka posiada dwie kopie poszczególnych chromosomów, a więc w przypadku wielu eksperymentów funkcjonalnych konieczna jest odpowiednia modyfikacja obu alleli genu.

W tradycyjnych strategiach CRISPR wykorzystujących naprawę ukierunkowaną homologicznie jednym z problemów pozostaje równoczesne dostarczenie do komórki zarówno komponentów odpowiadających za skierowanie systemu do określonego miejsca genomu, jak i odpowiedniego szablonu naprawczego. Przy eksperymentach obejmujących dużą liczbę genów problem ten ogranicza skalowalność całej procedury.

Christopher J. Cotter i Cong T. Trinh opisali CRISPR-GRIT – Guide RNAs with Integrated Repair Templates. Jest to konstrukcja, w której RNA przewodnikowy (gRNA) został zaprojektowany w powiązaniu z szablonem naprawczym. Według autorów takie rozwiązanie ma przyspieszać wykonywanie nokautów genowych i ułatwiać jednoczesną, wielokrotną edycję genomu C. albicans.

W praktyce znaczenie tego rozwiązania nie sprowadza się wyłącznie do możliwości zmodyfikowania pojedynczego genu. Docelowo chodzi o stworzenie platformy pozwalającej systematycznie ingerować w większą liczbę genów, a następnie obserwować skutki takich zmian dla wzrostu, przeżycia, metabolizmu lub innych właściwości komórki grzyba.

Co wykazano w opublikowanym badaniu?

Podstawę naukową technologii stanowi publikacja zatytułowana CRISPR-GRIT: Guide RNAs with Integrated Repair Templates Enable Precise Multiplexed Genome Editing in the Diploid Fungal Pathogen Candida albicans, której autorami są Christopher J. Cotter i Cong T. Trinh z Department of Chemical and Biomolecular Engineering, The University of Tennessee, Knoxville.

Praca została opublikowana w The CRISPR Journal. Autorzy zwrócili uwagę, że choć wcześniejsze systemy CRISPR-Cas usprawniły edycję genomu C. albicans, prowadzenie badań funkcjonalnych na dużą skalę nadal utrudniała konieczność dostarczania szablonów naprawczych potrzebnych do uzyskania homozygotycznych nokautów, czyli modyfikacji obu kopii badanego genu.

CRISPR-GRIT został opracowany jako strategia pozwalająca zintegrować szablon naprawczy z konstrukcją RNA przewodnikowego. Według autorów umożliwia ona sprawniejsze wykonywanie nokautów i wielokrotnych modyfikacji genomu diploidalnego C. albicans.

Istotnym potencjalnym zastosowaniem technologii jest prowadzenie wysokoprzepustowych przesiewowych badań bibliotek genetycznych. Zamiast analizować gen po genie, badacze mogą dążyć do równoległego sprawdzania znacznie większej liczby elementów genomu i identyfikowania tych, których zmiana prowadzi do określonego fenotypu.

Autorzy wskazali również na możliwość wykorzystania systemu do poszukiwania par genów wykazujących syntetyczną letalność. W takim układzie zaburzenie funkcji jednego z dwóch genów nie musi prowadzić do śmierci komórki, ale jednoczesne zaburzenie obu staje się dla niej letalne. Z punktu widzenia badań nad nowymi celami terapeutycznymi takie zależności są szczególnie interesujące, ponieważ mogą ujawniać biologiczne słabości komórki grzyba.

FACT i sztuczna inteligencja mają rozszerzyć badania na kolejne grzyby

CRISPR-GRIT jest tylko jednym z elementów szerszego programu badawczego zespołu Conga T. Trinha. Naukowcy opracowali również metodologię Fungal Advanced Chemical Transformation (FACT), której zadaniem jest analiza czynników wpływających na skuteczność wprowadzania materiału genetycznego i edycji genomu grzybów.

Transformacja komórek grzybowych nie przebiega identycznie u wszystkich gatunków. Komórki różnią się budową, fizjologią, odpowiedzią na stres, mechanizmami naprawy DNA oraz zdolnością do przyjmowania zewnętrznego materiału genetycznego. Warunki umożliwiające skuteczną modyfikację jednego gatunku mogą zatem okazać się nieefektywne w przypadku innego.

FACT ma służyć systematycznemu badaniu zależności pomiędzy właściwościami komórki, warunkami środowiskowymi a powodzeniem transformacji i późniejszej edycji genomu. W komunikacie University of Tennessee, Knoxville podano, że metodologia ta jest rozwijana w połączeniu z CRISPR-GRIT.

National Science Foundation przyznała Congowi Trinhowi i Seunghyunowi Ryu ponad 900 tys. dolarów na rozszerzenie obu rozwiązań na większą liczbę gatunków grzybów, również takich, które wcześniej były szczególnie trudne do modyfikacji genetycznej.

Badacze zamierzają połączyć wyniki eksperymentów z modelami wyjaśnialnej sztucznej inteligencji (explainable AI). Celem nie ma być jedynie statystyczne przewidywanie, czy określona procedura się powiedzie, lecz powiązanie konkretnych właściwości molekularnych i fizjologicznych komórek z wynikami edycji genomu. Model ma pomagać w wyborze warunków eksperymentalnych zwiększających prawdopodobieństwo skutecznej transformacji różnych gatunków grzybów.

Dlaczego skalowalność jest ważna?

Jeżeli metodę można zastosować wyłącznie do pojedynczych, dobrze scharakteryzowanych szczepów, jej wykorzystanie w genomice funkcjonalnej pozostaje ograniczone. Rozwiązanie działające w wielu gatunkach i różnych warunkach biologicznych mogłoby natomiast pozwolić na systematyczne badanie funkcji tysięcy genów oraz porównywanie mechanizmów biologicznych pomiędzy grzybami.

Takie zastosowania wykraczają poza mykologię medyczną. University of Tennessee, Knoxville wskazuje również na znaczenie platformy dla biotechnologii i biomanufacturingu, gdzie zmodyfikowane mikroorganizmy mogą być wykorzystywane do wytwarzania określonych związków.

Jak technologia może pomóc w badaniu oporności na leki przeciwgrzybicze?

Drugi z nowych projektów jest bardziej bezpośrednio związany z problemem zakażeń u ludzi. National Institutes of Health przyznały Congowi Trinhowi grant w wysokości 420 tys. dolarów na badania genów umożliwiających Candida albicans rozwój oporności na leki przeciwgrzybicze oraz dalsze badania nad potencjalnymi strategiami opartymi na CRISPR.

Kluczowym etapem jest tutaj właśnie ustalenie związku pomiędzy genotypem a fenotypem oporności. Samo wykrycie różnic w genomach szczepów wrażliwych i opornych nie przesądza jeszcze, które zmiany odpowiadają za określoną cechę. Edycja genomu pozwala natomiast eksperymentalnie zmienić konkretny gen i sprawdzić, czy wpływa to na zachowanie komórki.

W szerokiej perspektywie strategia taka może umożliwiać budowę map genów związanych z wrażliwością lub opornością na określone grupy leków. Może również pomagać w identyfikowaniu nowych potencjalnych celów molekularnych dla przyszłych leków przeciwgrzybiczych.

Istotne jest jednak rozróżnienie pomiędzy zastosowaniem CRISPR jako narzędzia badawczego a zastosowaniem go bezpośrednio jako terapii. Znacznie bliższym i bardziej realistycznym zastosowaniem platform funkcjonalnej genomiki jest obecnie identyfikowanie genów i szlaków metabolicznych, których zahamowanie inną metodą – przykładowo farmakologiczną – mogłoby osłabić komórkę grzyba lub przywrócić jej wrażliwość na leczenie.

Od narzędzia laboratoryjnego do potencjalnych zastosowań klinicznych jest jeszcze długa droga

Nagłówek komunikatu University of Tennessee, Knoxville sugeruje możliwość „usuwania DNA drożdżaków, aby ratować życie”, jednak obecny etap badań wymaga znacznie ostrożniejszej interpretacji. Opublikowana praca dotycząca CRISPR-GRIT opisuje przede wszystkim platformę edycji genomu i możliwości wykorzystania jej w genomice funkcjonalnej Candida albicans.

Nie jest to badanie kliniczne, nie oceniano skuteczności leczenia kandydozy u pacjentów i na podstawie dostępnego źródła naukowego nie można określać CRISPR-GRIT jako gotowej terapii przeciwgrzybiczej.

Z punktu widzenia epidemiologii zakażeń i problemu oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe znaczenie tych prac może polegać przede wszystkim na dostarczeniu narzędzi pozwalających szybciej identyfikować mechanizmy oporności oraz potencjalne słabe punkty patogenu. Dopiero dalsze badania będą mogły wykazać, które z takich odkryć da się przełożyć na rozwój nowych metod zapobiegania lub leczenia zakażeń grzybiczych.

Nowe granty oznaczają zatem przede wszystkim rozpoczęcie kolejnego etapu badań nad technologią. W przypadku projektu NIH szczególnie istotna będzie odpowiedź na pytanie, które geny C. albicans są rzeczywiście niezbędne dla powstawania i utrzymywania fenotypu lekooporności. Projekt finansowany przez NSF ma z kolei odpowiedzieć na bardziej fundamentalne pytanie: czy kombinację CRISPR-GRIT, FACT i modeli wyjaśnialnej sztucznej inteligencji można przekształcić w skalowalną platformę genomiki funkcjonalnej działającą w wielu różnych gatunkach grzybów.