Lityczny bakteriofag Vanta zakaża wielolekooporne szczepy Pseudomonas aeruginosa

Naukowcy ze Stanford University wyizolowali ze ścieków bakteriofaga Vanta, który zakaża bakterie Pseudomonas aeruginosa. Fag należy do rodzaju Yuavirus, ma genom dwuniciowego DNA o długości 61 663 par zasad i – zgodnie z analizą bioinformatyczną – z bardzo wysokim prawdopodobieństwem prowadzi lityczny cykl namnażania. W warunkach laboratoryjnych tworzył łysinki nie tylko na szczepach wykorzystywanych w badaniach mikrobiologicznych, ale również na dwóch wielolekoopornych izolatach klinicznych pochodzących z zakażenia odbytniczego i zakażenia oskrzeli.

Dlaczego Pseudomonas aeruginosa jest celem badań nad fagoterapią

Pseudomonas aeruginosa jest oportunistyczną, Gram-ujemną pałeczką zdolną do wywoływania zakażeń skóry, układu oddechowego, kości i innych narządów. Szczególne znaczenie kliniczne ma u pacjentów hospitalizowanych, osób z zaburzeniami odporności oraz chorych z przewlekłymi chorobami płuc, w tym z mukowiscydozą.

Bakteria ta dysponuje licznymi mechanizmami naturalnej i nabytej oporności na antybiotyki. Może ograniczać przenikanie leków przez osłony komórkowe, aktywnie usuwać antybiotyki za pomocą pomp wypływowych, wytwarzać enzymy unieczynniające leki oraz rozwijać biofilm, którego struktura utrudnia skuteczną penetrację substancji przeciwdrobnoustrojowych.

Wzrost częstości występowania szczepów wielolekoopornych sprawił, że P. aeruginosa stała się jednym z najważniejszych modeli badawczych dla rozwoju terapii bakteriofagowej. Bakteriofagi są wirusami zakażającymi bakterie. Fagi lityczne po wniknięciu do komórki przejmują jej aparat metaboliczny, namnażają własny materiał genetyczny i ostatecznie doprowadzają do rozpadu zakażonej bakterii.

Autorami opublikowanej w Microbiology Resource Announcements charakterystyki bakteriofaga Vanta są Aaryan Harshith, Zachary N. Flamholz, Paul L. Bollyky oraz Jessica C. Sacher z Division of Infectious Diseases, Stanford Department of Medicine, Stanford University.

Jak wyizolowano bakteriofaga Vanta

Materiałem wyjściowym były ścieki pobrane 11 lipca 2024 roku w Codiga Resource Recovery Center działającym przy Stanford University. Ścieki są jednym z najczęściej wykorzystywanych środowisk do poszukiwania bakteriofagów, ponieważ zawierają zróżnicowane populacje bakterii i odpowiadających im wirusów.

Próbkę rozcieńczono w buforze SM zawierającym 100 mmol/l chlorku sodu, 8 mmol/l siarczanu magnezu, 50 mmol/l Tris-HCl oraz 0,01% żelatyny. Następnie materiał poddano filtracji przez sterylny filtr z polieterosulfonu o średnicy porów 0,2 µm, co miało usunąć komórki bakteryjne i większe zanieczyszczenia, pozostawiając cząstki fagowe w przesączu.

W celu namnożenia fagów 200 µl przefiltrowanej próbki ścieków dodano do 5 ml hodowli P. aeruginosa PA14 znajdującej się we wczesnej fazie logarytmicznego wzrostu. Bakterie hodowano w podłożu LB Miller przez 4 godziny w temperaturze 37°C, przy wytrząsaniu z szybkością 250 obrotów na minutę.

Po inkubacji hodowlę dwukrotnie odwirowano przez 15 minut z przyspieszeniem 5000 × g w temperaturze 4°C. Supernatant ponownie przefiltrowano, a następnie naniesiono na murawę bakteryjną szczepu PA14.

Na podłożu pojawiła się okrągła, przezroczysta łysinka o średnicy około 2 mm. Fragment łysinki pobrano końcówką pipety P1000 i przeniesiono do 1 ml buforu SM. Procedurę wybierania pojedynczych łysinek powtarzano sekwencyjnie pięć razy, aby uzyskać izolowany, jednorodny materiał fagowy przed jego dalszym namnażaniem.

Jakie szczepy bakterii zakażał Vanta

Vanta tworzył łysinki na szczepie PA14, który wykorzystano do jego izolacji i namnażania. Zdolność tworzenia łysinek potwierdzono również dla szczepów mPAO1Δpf4Δpf6 i Li010.

Szczególnie istotna była obserwacja aktywności wobec dwóch wielolekoopornych izolatów klinicznych P. aeruginosa pochodzących z CDC & FDA Antimicrobial Resistance Isolate Bank. Izolat AR_0231 pochodził z zakażenia odbytniczego, natomiast AR_0238 – z zakażenia oskrzeli.

Morfologia bakteriofaga w mikroskopii elektronowej

Przed obrazowaniem cząstki bakteriofaga poddano barwieniu negatywowemu z użyciem 1-procentowego octanu uranylu. Preparaty analizowano przy napięciu przyspieszającym 120 kV w transmisyjnym mikroskopie elektronowym JEM1400 firmy JEOL.

W obrazie mikroskopowym Vanta miał główkę oraz długi, giętki i niekurczliwy ogon. Taka budowa jest typowa dla bakteriofagów opisywanych jako mające morfologię siphowirusów.

Średnia szerokość główki wynosiła 56 ± 2 nm, natomiast średnia długość ogona – 133 ± 5 nm. Pomiary wykonano dla 10 cząstek fagowych, a wartości przedstawiono jako średnią i odchylenie standardowe.

Sekwencjonowanie i charakterystyka genomu

Izolacja DNA i przygotowanie bibliotek

Przefiltrowany lizat fagowy poddano działaniu DNazy w stężeniu 2 U/ml, RNazy A w stężeniu 10 µg/ml oraz proteinazy K w stężeniu 30 µg/ml. DNA wyizolowano z wykorzystaniem zestawu DNeasy firmy Qiagen.

Biblioteki do sekwencjonowania całogenomowego przygotowano za pomocą Novogene Standard Microbial WGS PCR+ Kit. Sekwencjonowanie przeprowadzono na platformie Illumina NovaSeq X Plus Series w trybie PE150, czyli z odczytami sparowanymi o długości 150 zasad.

Uzyskano około 1,1 × 10⁷ odczytów sparowanych. Ich jakość zweryfikowano za pomocą programu FastQC w wersji 0.12.1. Adaptery, krótkie odczyty o długości nieprzekraczającej 100 zasad oraz odczyty o niskiej jakości usunięto za pomocą BBDuk w wersji 39.08.

Składanie i walidacja genomu

Zbiór danych zredukowano do pokrycia 80× za pomocą programu Seqtk w wersji 1.4. Sekwencję genomu złożono w programie MEGAHIT w wersji 1.2.9, a powstałe kontigi zwizualizowano za pomocą Bandage w wersji 0.8.1.

Walidację przeprowadzono programem BBMap w wersji 38.84. Autorzy uzyskali 100-procentowe pokrycie sekwencji odczytami, przy 31 851 zmapowanych odczytach. Analiza doprowadziła do uzyskania pojedynczego kontigu o długości 61 663 par zasad i zawartości guaniny oraz cytozyny wynoszącej 64,5%.

Sekwencję skorygowano za pomocą programu Pilon w wersji 1.24. Analiza w PhageTerm w wersji 1.0.12 wskazała, że genom był kompletny i miał strukturę kołowo permutowaną.

Adnotacja genów i klasyfikacja bakteriofaga

Genom zorientowano względem genu kodującego dużą podjednostkę terminazy, wykorzystując Geneious Prime w wersji 2026.0.2. Terminaza uczestniczy w rozpoznawaniu i pakowaniu DNA bakteriofaga do powstającego kapsydu.

Adnotację genomu wykonano za pomocą programu Pharokka w wersji 1.8.2. Do przewidywania genów zastosowano Prodigal w wersji 2.6.3, do określania potencjalnych funkcji białek – bazę PHROGs, natomiast do poszukiwania genów transferowego RNA – tRNAscan w wersji 2.0.12.

W genomie Vanta zidentyfikowano 86 sekwencji kodujących białka. Nie wykryto genów tRNA. Analiza przeprowadzona za pomocą BACPHLIP w wersji 0.9.6 wskazała z 98-procentową pewnością, że Vanta prowadzi lityczny, a nie lizogeniczny tryb życia.

Analiza filogenetyczna przeprowadzona w serwisie Phylogeny.fr z użyciem programu FastTree zaklasyfikowała Vanta do rodzaju Yuavirus. Wynik potwierdzono za pomocą serwera VIPTree, wykorzystując bakteriofaga AAT1 jako grupę zewnętrzną.

Wszystkie narzędzia bioinformatyczne uruchamiano z parametrami domyślnymi, o ile autorzy nie wskazali inaczej.

Dostępność danych

Adnotowana sekwencja genomu bakteriofaga Vanta została zdeponowana w NCBI GenBank pod numerem PQ628237. Surowe odczyty sekwencyjne udostępniono w ramach BioProject PRJNA1267729 oraz w Sequence Read Archive pod numerem SRR36199512.

Publikacja została przyjęta 14 lipca 2026 roku i opublikowana online 31 lipca 2026 roku. Artykuł udostępniono na licencji Creative Commons Attribution 4.0 International. Autorzy poinformowali również, że Jessica C. Sacher jest współzałożycielką Phage Directory.

Znaczenie wyników i najważniejsze ograniczenia

Opis bakteriofaga Vanta poszerza katalog znanych fagów zakażających P. aeruginosa. Szczególne znaczenie ma potwierdzenie tworzenia łysinek na dwóch wielolekoopornych izolatach klinicznych, w tym na szczepie pochodzącym z zakażenia oskrzeli.

Wynik ten może uzasadniać dalszą ocenę Vanta jako potencjalnego składnika preparatów fagowych lub koktajli łączących kilka bakteriofagów o uzupełniających się zakresach gospodarzy. W praktyce klinicznej pojedynczy fag rzadko zakaża wszystkie izolaty danego gatunku, dlatego przy opracowywaniu fagoterapii istotne jest tworzenie odpowiednio dobranych zestawów fagów i wcześniejsze badanie wrażliwości izolatu pacjenta.

Publikacja nie przedstawia jednak wyników doświadczeń na modelach zwierzęcych ani danych pochodzących od pacjentów. Nie oceniano wpływu Vanta na przebieg zakażenia, biofilm, śmiertelność bakterii w warunkach fizjologicznych, odpowiedź immunologiczną gospodarza ani skuteczność połączenia faga z antybiotykami.

Wnioski

Bakteriofag Vanta jest litycznym przedstawicielem rodzaju Yuavirus, wyizolowanym ze ścieków z wykorzystaniem P. aeruginosa PA14. Ma długi, niekurczliwy ogon, genom dsDNA o długości 61 663 par zasad oraz 86 przewidywanych sekwencji kodujących.

Najważniejszą obserwacją z perspektywy epidemiologii zakażeń i narastającej oporności na antybiotyki jest zdolność Vanta do tworzenia łysinek na dwóch wielolekoopornych izolatach klinicznych P. aeruginosa. Wynik wskazuje, że fag może być wartościowym obiektem dalszych badań, zwłaszcza nad zakresem gospodarzy, aktywnością przeciwbiofilmową, ryzykiem rozwoju oporności fagowej oraz możliwością łączenia z antybiotykami.

Źródło: Microbiology Resource Announcements, Isolation and genomic characterization of bacteriophage Vanta, a lytic Yuavirus infecting clinical strains of Pseudomonas aeruginosa.
DOI: https://doi.org/10.1128/mra.00466-25