Białkowy „transport molekularny” grzybów może wskazać nowe cele terapii przeciwgrzybiczych

Naukowcy z Universität Münster oraz National and Kapodistrian University of Athens opisali z wysoką rozdzielczością strukturę UapA – błonowego transportera puryn występującego u modelowego grzyba Aspergillus nidulans. Badanie ujawniło szczegóły mechanizmu transportu składników odżywczych do komórki grzyba, a także rolę lipidów błonowych, cząsteczek wody i dotychczas niedocenianego fragmentu białka. Wyniki mają przede wszystkim znaczenie dla biologii strukturalnej, ale w przyszłości mogą pomóc w projektowaniu strategii przeciwdrobnoustrojowych wykorzystujących transportery grzybowe jako cele terapeutyczne lub drogi wprowadzania leków do komórek patogenów.

Dlaczego transportery grzybów są ważne

Błona komórkowa nie jest bierną barierą oddzielającą wnętrze komórki od środowiska. Znajdujące się w niej białka transportowe selektywnie kontrolują pobieranie składników odżywczych, jonów i innych cząsteczek oraz usuwanie niektórych produktów przemiany materii. Z tego względu transportery błonowe bywają określane jako molekularni „strażnicy” albo „bramkarze” komórki.

W przypadku grzybów transportery umożliwiają pozyskiwanie z otoczenia związków niezbędnych do wzrostu, metabolizmu i przeżycia. Ich prawidłowe działanie może mieć szczególne znaczenie dla gatunków chorobotwórczych, które muszą adaptować się do warunków panujących w organizmie gospodarza i konkurować z jego komórkami o dostępne składniki odżywcze.

Badacze z Universität Münster i National and Kapodistrian University of Athens skoncentrowali się na transporterze UapA występującym u Aspergillus nidulans. Jest to gatunek szeroko wykorzystywany jako organizm modelowy w badaniach genetyki, metabolizmu i biologii komórkowej grzybów. Sam A. nidulans nie jest najważniejszym czynnikiem etiologicznym aspergilozy, jednak poznanie jego mechanizmów komórkowych może dostarczać informacji istotnych także dla innych przedstawicieli rodzaju Aspergillus.

Czym jest transporter UapA

UapA jest eukariotycznym transporterem purynowym odpowiedzialnym za przenoszenie określonych związków purynowych przez błonę komórkową grzyba. Puryny są składnikami wielu kluczowych cząsteczek biologicznych, w tym kwasów nukleinowych, nukleotydów energetycznych oraz koenzymów. Dostęp do ich prekursorów i pochodnych ma zatem istotne znaczenie dla funkcjonowania komórki.

Transportery podobne do UapA należą do szerokiej grupy białek błonowych, których aktywność zależy nie tylko od samej sekwencji aminokwasów, lecz również od wzajemnych oddziaływań pomiędzy domenami białka, lipidami błonowymi, cząsteczkami wody i transportowanym substratem.

Autorzy pracy zwracają uwagę, że również u człowieka występują homologiczne białka transportowe. Ludzkie transportery z tej grupy uczestniczą między innymi we wspólnym transporcie witaminy C i jonów sodu. Nie oznacza to jednak, że transporter grzybowy i jego ludzkie odpowiedniki są identyczne. Podobieństwo ewolucyjne umożliwia natomiast porównywanie zasad organizacji i pracy tych białek.

Mechanizm transportu typu „winda”

Uzyskane dane wskazują, że UapA działa według mechanizmu określanego jako mechanizm typu „winda” – elevator-type mechanism. W takim modelu transporter składa się z co najmniej dwóch funkcjonalnie odmiennych części.

Pierwszą jest względnie nieruchoma domena rusztowania, zakotwiczona w błonie i tworząca stabilną podstawę całej struktury. Drugą stanowi ruchoma domena transportowa, która wiąże substrat, a następnie przemieszcza się względem domeny rusztowania. Ruch ten pozwala przenieść związaną cząsteczkę z jednej strony błony na drugą.

Proces nie jest prostym mechanicznym przesunięciem jednej części białka. Wymaga precyzyjnej koordynacji zmian konformacyjnych, oddziaływań z cząsteczkami wody oraz kontaktów z lipidami tworzącymi błonę komórkową. Do tej pory szczegółowe poznanie tego mechanizmu było utrudnione ze względu na brak struktur UapA o odpowiednio wysokiej rozdzielczości.

Co ujawniła kriomikroskopia elektronowa

Zespół kierowany przez prof. Christosa Gatsogiannisa, działający w Institut für Medizinische Physik und Biophysik oraz Center for Soft Nanoscience na Universität Münster, zastosował kriomikroskopię elektronową, czyli cryo-EM. Metoda ta umożliwia określanie trójwymiarowej struktury białek i kompleksów molekularnych w stanie zbliżonym do naturalnego, bez konieczności ich klasycznej krystalizacji.

Naukowcy zobrazowali UapA w dwóch różnych stanach strukturalnych. Uzyskane struktury osiągnęły rozdzielczość 2,05 Å, czyli 0,205 nanometra. Według Universität Münster jest to jedna z najwyższych rozdzielczości uzyskanych dotychczas przy określaniu struktury eukariotycznego transportera błonowego.

Tak wysoka rozdzielczość pozwoliła badaczom przeanalizować nie tylko ogólną architekturę białka, lecz także położenie wybranych cząsteczek wody i lipidów otaczających transporter. Jest to szczególnie ważne, ponieważ środowisko lipidowe może stabilizować określone stany białka i wpływać na tempo oraz kierunek zmian konformacyjnych.

Nieoczekiwana rola początkowego fragmentu białka

Jedno z najważniejszych spostrzeżeń dotyczyło fragmentu znajdującego się na początku łańcucha białkowego UapA. Wcześniej przyjmowano, że obszar ten nie tworzy trwałej, uporządkowanej struktury. Nowe dane wskazują jednak, że pełni on co najmniej dwie funkcje.

Po pierwsze, uczestniczy w prawidłowym fałdowaniu transportera oraz jego kierowaniu do powierzchni komórki. Po drugie, współreguluje aktywność transportową białka. Oznacza to, że fragment uznawany wcześniej za strukturalnie nieuporządkowany może wpływać zarówno na dojrzewanie UapA, jak i na sposób jego działania w błonie komórkowej.

Zaobserwowane mechanizmy pozostają zgodne z wcześniejszymi badaniami genetycznymi i funkcjonalnymi prowadzonymi przez zespół prof. George’a Diallinasa z Department of Biology na National and Kapodistrian University of Athens. Połączenie danych strukturalnych, genetycznych i funkcjonalnych wzmacnia interpretację dotyczącą sposobu regulacji transportera.

Możliwe znaczenie dla terapii przeciwgrzybiczych

Inwazyjne zakażenia grzybicze stanowią szczególne zagrożenie dla osób z zaburzeniami odporności, pacjentów leczonych onkologicznie, chorych po transplantacji narządów lub komórek krwiotwórczych, osób otrzymujących intensywne leczenie immunosupresyjne oraz części pacjentów hospitalizowanych w oddziałach intensywnej terapii.

Niektóre gatunki Aspergillus, zwłaszcza Aspergillus fumigatus, mogą wywoływać ciężkie zakażenia układu oddechowego i infekcje rozsiane. Leczenie aspergilozy jest utrudnione między innymi przez ograniczoną liczbę klas leków przeciwgrzybiczych, toksyczność części preparatów, interakcje lekowe oraz rozwój oporności.

Poznanie struktur transporterów grzybowych może mieć w przyszłości dwa potencjalne zastosowania. Pierwszym jest projektowanie cząsteczek, które zaburzałyby pobieranie przez grzyba składników niezbędnych do przeżycia. Drugim – wykorzystanie naturalnych transporterów jako swoistych „dróg wejścia” dla leków lub ich pochodnych do komóki grzyba.

Autorzy wskazują, że transportery podobne do UapA mogą uczestniczyć we wprowadzaniu substancji przeciwgrzybiczych do komórki. Szczegółowa znajomość miejsca wiązania substratu, zmian konformacyjnych i oddziaływań z lipidami może zatem pomóc w racjonalnym projektowaniu związków o lepszym powinowactwie do transportera.

Selektywność pozostaje kluczowym wyzwaniem

Obecność homologicznych transporterów u człowieka oznacza jednocześnie, że przyszłe strategie terapeutyczne muszą uwzględniać selektywność. Lek działający na białko grzybowe nie powinien istotnie hamować jego ludzkich odpowiedników ani zaburzać fizjologicznego transportu witamin lub jonów.

Do opracowania bezpiecznego leku konieczne byłoby zidentyfikowanie różnic strukturalnych pomiędzy transporterami grzybowymi i ludzkimi, a następnie wykorzystanie tych różnic do stworzenia związku wybiórczo oddziałującego z białkiem patogenu.

Ograniczenia badania i najważniejsze wnioski

Najważniejszą wartością pracy jest przedstawienie niezwykle szczegółowego obrazu molekularnej organizacji transportera purynowego UapA. Badanie pokazuje, w jaki sposób współdziałają domeny białka, lipidy błonowe, cząsteczki wody i region N-końcowy transportera.

Wyniki poszerzają wiedzę o biologii komórek grzybowych i mogą ułatwić identyfikację nowych celów molekularnych. Droga od struktury białka do nowego leku pozostaje jednak długa i obejmuje między innymi projektowanie związków, badania aktywności wobec klinicznie istotnych patogenów, ocenę selektywności względem białek człowieka, doświadczenia na modelach zakażeń oraz kolejne fazy badań przedklinicznych i klinicznych.

Źródło: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Cryo-EM of the eukaryotic purine transporter UapA demonstrates intramolecular and lipid regulation of transport.
DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.2513585123